β-catenin的異常表達(dá)在原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生、分化中的意義.pdf

1、背景： 原發(fā)性肝細(xì)胞癌是一種嚴(yán)重危脅人類健康的常見惡性腫瘤之一<'[1]>，由于其起病隱匿、發(fā)展快、轉(zhuǎn)移早、術(shù)后易復(fù)發(fā)等特點，死亡率較高。雖然原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)病原因已經(jīng)有較多研究，但確切的原因仍不十分清楚，所以防治十分困難。目前越來越多的研究者將注意力集中在肝癌的發(fā)病機理，明確發(fā)病機理，通過早期干預(yù)發(fā)病過程可能是防治原發(fā)性肝細(xì)胞癌的有效手段之一。近年來，國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)wnt信號通路的異常激活與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展有密切

2、關(guān)系，而β-catenin(β-連環(huán)素)又是wnt信號通路中的非常重要的蛋白之一，wnt信號主要通過調(diào)節(jié)β-catenin的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、分化和胚胎幼稚組織的發(fā)育，因此β-catenin可能在原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、分化和轉(zhuǎn)移中有重要作用，通過調(diào)節(jié)β-catenin的表達(dá)可能對防治原發(fā)性肝細(xì)胞癌有積極意義。 β-catenin在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)國內(nèi)外均有報道，但是將正常肝組織、肝硬化和肝癌組織進(jìn)行對比研究的報道

3、甚少，這種表達(dá)是否與肝臟特殊的微環(huán)境和結(jié)構(gòu)有關(guān)尚不清楚。我們通過動態(tài)觀察β-catenin在這一發(fā)病過程中的異位表達(dá)情況，進(jìn)一步說明β-catenin與肝癌的密切關(guān)系，對比研究β-catenin在體外培養(yǎng)的細(xì)胞株中的表達(dá)初步揭示這種表達(dá)與肝臟特殊的微環(huán)境和結(jié)構(gòu)的關(guān)系，為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。臨床上發(fā)現(xiàn)大多數(shù)肝癌合并肝硬化，肝硬化患者肝癌的發(fā)病率較高，因此人們懷疑肝炎后肝硬化為肝細(xì)胞肝癌的癌前病變，但直接證據(jù)不足，難于揭示其中的機理

4、，通過對比研究β-eatenin的表達(dá)可能揭示肝硬化與肝癌的關(guān)系。 近年來人們在肝癌、肝硬化組織中發(fā)現(xiàn)了肝干細(xì)胞即卵圓細(xì)胞(HOC)，該細(xì)胞具有較強的增生、分裂能力，推測肝癌來源于肝干細(xì)胞(HSC)的異常分化。目前關(guān)于肝干細(xì)胞的研究主要集中在形態(tài)和增生、誘導(dǎo)分化方面，從β-catenin的表達(dá)情況來說明其惡性轉(zhuǎn)化的潛能的研究未見文獻(xiàn)報道。因此通過分析β-catenin的異位表達(dá)來初步揭示原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生、分化、轉(zhuǎn)移機理以及原

5、發(fā)性肝癌與肝硬化和肝干細(xì)胞的關(guān)系，對于原發(fā)性肝細(xì)胞癌的臨床防治和基礎(chǔ)研究具有深遠(yuǎn)意義。 目的： 探討β-catenin的異位表達(dá)在原發(fā)性肝癌的形成、發(fā)展、分化中的作用，為臨床早期診斷、治療和預(yù)后評估提供新的思路，為原發(fā)性肝細(xì)胞癌的干細(xì)胞起源和肝硬化與肝癌的關(guān)系提供理論證據(jù)。 材料與方法： 1．收集肝癌組織(40例)、正常肝組織(20例)、肝硬化組織(20例)，購買HepG2(人肝癌細(xì)胞株)、SMCC(人肝

6、癌細(xì)胞株)、WB(大鼠肝干細(xì)胞)、L2(大鼠正常肝細(xì)胞)細(xì)胞株。 2．利用免疫組織化學(xué)染色法和western-blotting法分析β-catenin在正常肝組織、肝硬化組織、肝癌組織以及高分化、中分化、低分化肝癌組織中的的表達(dá)差異。 3．體外培養(yǎng)HepG2、SMCC、WB、L2細(xì)胞株。DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)肝HepG2、SMCC、L2，DMEMFl2培養(yǎng)基體外培養(yǎng)WB。 4．利用免疫熒光技術(shù)檢測肝干細(xì)胞表面c-

7、kit抗原來鑒定干細(xì)胞。 5． HepG2、SMCC、WB、L2細(xì)胞株進(jìn)行爬片培養(yǎng)，利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法和western-blotting法對比分析β-catenin在HepG2、SMCC、WB、L2細(xì)胞株的表達(dá)差異。 結(jié)果： 1．免疫組織化學(xué)顯示，正常肝組織中，β-catenin幾乎全部分布于細(xì)胞膜，僅個別細(xì)胞的細(xì)胞漿中出現(xiàn)較淺的棕黃色染色。肝炎后肝硬化組織中大部分細(xì)胞膜上有明顯的棕黃色染色，部分細(xì)胞的細(xì)胞漿

8、中出現(xiàn)棕黃色染色其細(xì)胞膜和細(xì)胞核的異位表達(dá)與正常肝組織表達(dá)有差異(P<0.05)。原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中幾乎所有的細(xì)胞膜未出現(xiàn)棕黃色染色，細(xì)胞膜表達(dá)有明顯的缺失，大部分細(xì)胞漿中出現(xiàn)清晰的深棕黃色染色，高于肝炎后肝硬化組織(P<0.05)和正常肝組織(P<0.05)。Western-blotting法顯示正常肝組織細(xì)胞漿中有少量β-catenin表達(dá)，細(xì)胞核中未見表達(dá)，肝癌組織細(xì)胞漿、細(xì)胞核中有明顯積聚。 2．在高分化肝癌組織中，部

9、分細(xì)胞膜上有β-catenin表達(dá)，多數(shù)細(xì)胞漿中出現(xiàn)較淺的棕黃色染色，中分化肝癌組織中，細(xì)胞膜未見明顯表達(dá)，大部分細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色染色，其染色程度較高分化為深。低分化肝癌組織所有的細(xì)胞膜未出現(xiàn)棕黃色染色，所有胞漿中出現(xiàn)清晰的深棕黃色染色，且染色較深。 3．免疫熒光技術(shù)檢測到肝干細(xì)胞表面c-ldt抗原，WB細(xì)胞顯示出較強的熒光(圖15)。 4．免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)現(xiàn)L2細(xì)胞株中β-catenin主要分布于細(xì)胞膜，細(xì)胞漿中未見明

10、顯表達(dá)。WB細(xì)胞中β-catenin在細(xì)胞漿有一定的表達(dá)，在HepG2、SMCC細(xì)胞株中β-catenin主要分布于細(xì)胞漿中，細(xì)胞膜未見明顯表達(dá)。β-catenin在HepG2細(xì)胞株的胞漿表達(dá)多于SMCC。Western-blotting法顯示，β-catenin在HepG2、SMCC的胞漿、胞核中的表達(dá)明顯高于WB和L2細(xì)胞株，WB的胞漿、胞核中的表達(dá)高于L2細(xì)胞株，同時HepG2的胞漿、胞核中的表達(dá)高于SMCC細(xì)胞株。 結(jié)論

11、： 1．正常肝組織、肝硬化組織到原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織β-catenin發(fā)生了由細(xì)胞膜向細(xì)胞漿、細(xì)胞核表達(dá)異常，這種異常表達(dá)在原發(fā)性肝細(xì)胞癌的形成、發(fā)展過程中可能具有重要作用。 2．肝硬化可能為肝細(xì)胞癌的癌前病變。 3．β-catenin由細(xì)胞膜向細(xì)胞漿、細(xì)胞核的異位表達(dá)與肝細(xì)胞癌的分化有關(guān)，異位表達(dá)愈明顯，肝細(xì)胞癌的分化程度愈低。 4．體外細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果表明β-catenin的異常表達(dá)與肝臟的特殊結(jié)構(gòu)以及肝