ScPDCD5蛋白溶液結(jié)構(gòu)、主鏈動(dòng)力學(xué)及其功能研究.pdf

1、人PDCD5是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的促細(xì)胞凋亡因子，盡管其參與程序性細(xì)胞死亡調(diào)控的作用機(jī)制尚未十分清楚。新近的研究顯示其參與Tip60-p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路。人PDCD5的N-末端螺旋區(qū)和核心螺旋區(qū)的NMR結(jié)構(gòu)已被兩個(gè)不同研究小組分開(kāi)解析，截至我們文章發(fā)表時(shí)尚無(wú)PDCD5家族蛋白完整結(jié)構(gòu)被報(bào)道。PDCD5是一個(gè)進(jìn)化保守的基因。
　　 本論文由三章組成。第一章綜述了常用的順磁探針、順磁弛豫增強(qiáng)(PRE)理論及其在鑒定瞬態(tài)的、低豐度的生物

2、大分子及其復(fù)合物中的應(yīng)用。
　　 釀酒酵母YMR074c編碼一個(gè)PDCD5同源蛋白Ymr074cp。在第二章中，我們采用多維異核NMR技術(shù)研究Ymr074cp在溶液狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和主鏈動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)Ymr074cp有一個(gè)相對(duì)剛性的核心結(jié)構(gòu)區(qū)(aa43-105)，其獨(dú)立折疊成一個(gè)拓展的3股螺旋束；核心結(jié)構(gòu)兩端各存在一個(gè)無(wú)結(jié)構(gòu)區(qū)段。鑒于Ymr074cp第8-116aa被預(yù)測(cè)為一個(gè)dsDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，我們最終選擇1-116aa(N116

3、)和36-116aa(△81△)用于結(jié)構(gòu)測(cè)定及其主鏈動(dòng)力學(xué)分析。
　　 △81△核心區(qū)折疊成一個(gè)拓展的三股螺旋束，在α4與α5之間有一段6個(gè)氨基酸殘基的“可變動(dòng)的”loop；核心的兩端為柔性尾巴。通過(guò)測(cè)定△81△主鏈15N弛豫參數(shù)，并進(jìn)行reduced spectral density mapping(約化譜密度映射)和旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散張量分析，我們發(fā)現(xiàn)它的overall tumbling有明確的相關(guān)時(shí)間(τm≈8.2ns)，在溶液狀態(tài)

4、下，△81△表現(xiàn)出輕微的旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散各向異性。Model-free動(dòng)力學(xué)參數(shù)揭示：在△81△中，核心螺旋構(gòu)架了一個(gè)“相對(duì)剛體”，側(cè)翼螺旋可以進(jìn)行微調(diào)；與核心螺旋不同，在“可變動(dòng)的”loop(α4/α5)和末端均表現(xiàn)出相對(duì)較大的主鏈柔性。
　　 通過(guò)測(cè)定N116主鏈15N弛豫速率并結(jié)合約化譜密度映射和Lipari-Szabo映射，我們發(fā)現(xiàn)譜密度函數(shù)勾畫了N116二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的頻譜，核心螺旋的運(yùn)動(dòng)動(dòng)力匯聚于低頻，非結(jié)構(gòu)區(qū)的運(yùn)動(dòng)動(dòng)力則向高

5、頻散開(kāi)。N116(1-42)為一個(gè)相當(dāng)柔性的區(qū)段，盡管如此，多個(gè)證據(jù)(CSI、中短程特征NOEs和弛豫數(shù)據(jù))均揭示出3-15aa形成一段α-螺旋，并且它可能經(jīng)歷著不同于核心結(jié)構(gòu)區(qū)的overalltumbling運(yùn)動(dòng)。由此可見(jiàn)，在N116中存在3種較為典型的狀態(tài)：(1)以核心螺旋為代表的“相對(duì)剛體”；(2)以N116(18-40)為代表的高度無(wú)序狀態(tài)；(3)以N116(4-15；α1)為代表的第三種狀態(tài)。
　　 N116(1-42

6、)與核心結(jié)構(gòu)沒(méi)有直接接觸，因?yàn)樵谒鼈冎g觀察不到明顯的分子內(nèi)NOE。有鑒于此，我們通過(guò)位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記技術(shù)(SDSL)分別在A7C和A11C引入自旋標(biāo)記，結(jié)合PRE技術(shù)來(lái)映射N116中長(zhǎng)程相互作用，結(jié)果觀察到了較為明顯的長(zhǎng)程相互作用。順磁中心與某個(gè)主鏈氨基質(zhì)子的距離約束(dR)被詮釋成一個(gè)經(jīng)r-6權(quán)重的、時(shí)間和系綜平均距離，以半定量方式約束dR，但取的邊界相對(duì)寬松(±4(A))，最后得到一個(gè)NMR結(jié)構(gòu)系綜。因?yàn)橛?jì)算的結(jié)構(gòu)整合了多種構(gòu)象

7、的特征，并且它比溶液狀態(tài)下的真實(shí)狀態(tài)要顯得緊湊些，因此我們用一個(gè)NMR結(jié)構(gòu)系綜來(lái)描述N116在溶液中的狀態(tài)。從NMR滴定實(shí)驗(yàn)也獲得一點(diǎn)啟示：N116核心結(jié)構(gòu)內(nèi)“可變動(dòng)的”loop可能介導(dǎo)N116與dsDNA結(jié)合，但結(jié)合能力很弱。同源結(jié)構(gòu)比較揭示出PDCD5核心結(jié)構(gòu)區(qū)在進(jìn)化中、尤其是從酵母到人的進(jìn)化中相對(duì)保守，其N-末端殘基則經(jīng)歷從高度無(wú)序到相對(duì)有序的轉(zhuǎn)變過(guò)程。
　　 在第三章我們初步探討了YMR074c過(guò)表達(dá)的促酵母凋亡樣死亡效

8、應(yīng)。我們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：YMR074c過(guò)表達(dá)沒(méi)有引發(fā)、但是明顯促進(jìn)H2O2引發(fā)的酵母凋亡樣死亡，并且Ycalp metacaspase部分介導(dǎo)了這一過(guò)程；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)酵母其它c(diǎn)aspase-like蛋白酶也介導(dǎo)YMR074c過(guò)表達(dá)的促凋亡效應(yīng)。過(guò)表達(dá)N-末端缺失突變體蛋白大大削弱Ymr074cp的促細(xì)胞凋亡效應(yīng)。這些結(jié)果表明Ymr074cp參與H2O2引發(fā)的酵母凋亡樣死亡過(guò)程，盡管具體作用機(jī)制尚未明了。再結(jié)合第二章的同源結(jié)構(gòu)比較數(shù)據(jù)，我們有