鼠李糖乳桿菌上清液對(duì)酒精性肝損傷Toll樣受體4和Th17通路的影響.pdf

1、目的:
　　酒精性肝損傷是由于長(zhǎng)期大量飲酒引起肝功能異常，凝血功能障礙，嚴(yán)重時(shí)可以引起肝性腦病等并發(fā)癥最終可導(dǎo)致死亡[1]。持續(xù)大量的飲酒可導(dǎo)致肝細(xì)胞的脂肪變性，肝細(xì)胞凋亡壞死進(jìn)一步進(jìn)展為酒精性肝纖維化，肝細(xì)胞繼續(xù)損傷可繼續(xù)演變?yōu)榫凭愿斡不踔粮伟2]。然而至今為止，酒精引起肝損傷的機(jī)制仍不明確，有研究表明可能是因?yàn)榫凭拇x產(chǎn)物乙醇或者酒精本身引起機(jī)體內(nèi)毒素的升高導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷[3]。大量的研究證實(shí)由于脂多糖(lipopo

2、lysaccharide，LPS)和Kuffer細(xì)胞表面的Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)結(jié)合導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥因子和趨化因子從而引起肝臟損傷[4-6]。
　　鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus Gorbach Goldin，LGG)是益生菌的一種，近來(lái)研究已證實(shí)益生菌的攝入對(duì)脂肪肝、冠狀動(dòng)脈硬化癥、肝硬化以及酒精性肝損傷等疾病均有保護(hù)作用[7-10]。有研究表明大量攝入

3、益生菌活菌對(duì)于腸道功能紊亂和免疫功能異常的患者存在一定的不安全因素[11]。最近研究表明鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)的上清液(Lactobacillus rhamnosus Gorbach Goldin culturesupernatant，LGG-s)能夠減少酒精引起的腸道通透性增加和內(nèi)毒素的分泌從而起到保護(hù)肝臟的功能[12]。
　　該論文旨在研究鼠李糖乳桿菌上清液對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步的探討其對(duì)具有免疫調(diào)節(jié)作用的Th17和TL

4、R4通路的影響。
　　方法:
　　取健康10周左右雄性C57BL/6小鼠30只，利用隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組(6只)、酒精組（12只）、LGG-s+酒精組（12只）。酒精組小鼠用含有5％酒精的Lieber-DeCarli液體飼料喂養(yǎng)10天，第11天清晨按小鼠體重5 g/kg予40％酒精灌胃，并予灌胃9h后麻醉處死;對(duì)照組小鼠飲用不含酒精的Lieber-DeCarli液體飼料等熱量喂養(yǎng)同等時(shí)間后予5％麥芽糖灌胃，并予灌胃9h后麻醉

5、處死;LGG-s+酒精組小鼠用LGG-s加含5％酒精的Lieber-DeCarli液體的混合飼料等熱量喂養(yǎng)同等時(shí)間后予40％酒精灌胃，并予灌胃9h后麻醉處死。收集各組小鼠肝臟組織予HE和油紅O染色，觀察肝組織病理和脂肪性改變。收集各組小鼠的血清檢測(cè)ALT，AST和TG含量。RT-PCR檢測(cè)各組小鼠腸道緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1 mRNA表達(dá)。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot，WB)檢測(cè)各組小鼠肝

6、臟TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)、白介素-1受體相關(guān)激酶（IRAK-1）、核因子-κB(NF-κB)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的蛋白表達(dá)。流式細(xì)胞分析LGG-s對(duì)各組小鼠脾臟和肝臟中Th17含量的影響。
　　結(jié)果:
　　1.成功培養(yǎng)、提取LGG-s。LGG菌種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，菌液梯度稀釋至10-8后，接種至MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，檢查白色菌落數(shù)超過10個(gè)，由此成功培養(yǎng)出LGG菌種含量109

7、 CFU/mL菌落形成。將培養(yǎng)的LGG菌液離心成功分離出LGG-s。
　　2.血清生化學(xué)檢測(cè)分析顯示，酒精組小鼠ALT(147.17±47.339) U/L、AST(373±169.995) U/L和TG(0.86±0.226) mmol/L值相較于對(duì)照組小鼠ALT(54.83±11.356) U/L、AST(215.5±57.566) U/L和TG(0.40±0.081) mmol/L值有顯著的升高，LGG-s+酒精組小鼠的AL

8、T和AST相較于酒精組小鼠有明顯的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，LGG-s+酒精組小鼠的TG較酒精組小鼠有一定的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.肝組織病理結(jié)果HE染色和冰凍結(jié)果油紅O染色顯示，酒精組小鼠肝臟內(nèi)脂滴較大，數(shù)量明顯多于對(duì)照組小鼠，經(jīng)LGG-s干預(yù)后脂滴的數(shù)量和大小相對(duì)于酒精組小鼠有明顯改善。
　　4.小腸組織RT-PCR結(jié)果示，酒精組小鼠腸道的緊密連接蛋白ZO-1(0.504±0.08

9、67)、occludin(0.494±0.1109)和claudin-1(0.437±0.0969) mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組小鼠，LGG-s+酒精組小鼠的緊密連接蛋白ZO-1(0.759±0.0914)、occludin(0.789±0.0904)和claudin-1(0.794±0.0794)相對(duì)于酒精組小鼠表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　5.小鼠血清LPS檢測(cè)顯示，酒精組小鼠LPS(0.501±0.

10、1262) EU/ml值相對(duì)于對(duì)照組小鼠LPS(0.139±0.0611) EU/ml有明顯的升高，經(jīng)LGG-s干預(yù)后小鼠LPS(0.236±0.0815)EU/ml明顯降低，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　6.肝組織蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)示，酒精組的TLR4、MyD88、IRAK-1、NF-κB和TNF-α的蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，LGG-s+酒精組TLR4通路中各蛋白的表達(dá)得到明顯的抑制，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

11、P＜0.01)。
　　7.血液和脾臟淋巴細(xì)胞的流式分析結(jié)果示，酒精組小鼠血液內(nèi)Th17占CD4+的比例(9.550±4.8324)％明顯高于對(duì)照組小鼠(3.445±1.5623)％，經(jīng)LGG-s干預(yù)后小鼠血液內(nèi)Th17占CD4+的比例得到明顯的抑制，各組數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。同樣酒精組小鼠脾臟內(nèi)Th17占CD4+的比例(9.973±3.0175)％也明顯高于對(duì)照組小鼠(3.465±1.5785)％，經(jīng)LGG-s干

12、預(yù)后Th17量得到明顯的抑制，各組數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.LGG-s可以抑制酒精對(duì)肝臟組織和腸道的損傷，降低血清ALT、AST表達(dá)水平，同時(shí)能夠增加腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，保護(hù)腸道的通透性的穩(wěn)定。
　　2.LGG-s能夠抑制酒精性肝損傷中的TLR4通路的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，從而抑制酒精對(duì)肝臟的損傷。
　　3.LGG-s能夠降低酒精性肝損傷中的免疫調(diào)節(jié)因子Th17細(xì)胞的表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)