鼠李糖乳桿菌的篩選、鑒定及加工特性研究.pdf

1、益生菌在促進人體健康和防止疾病發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。本論文從大量分離獲得的乳酸菌菌株中，篩選具有優(yōu)良特性的益生菌，并對其進行鑒定，為研究和開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的益生菌產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。 本論文從三個方面開展研究：即乳酸菌功能特性研究，以篩選獲得性能良好的益生菌；對篩選獲得的益生菌進行鑒定；益生菌加工特性研究。 對分離的乳酸菌進行耐酸和耐膽汁酸鹽試驗，供試的15個菌株都能在pH3、0.3％膽汁酸鹽中存活；供試菌株中有10個能

2、在pH2、0.3％膽汁酸鹽中存活5h，其中Q菌的生長情況最好，其耐受能力最強；在pH3、0.2％膽汁酸鹽下只有Q菌能繼續(xù)生長。 對分離的乳酸菌進行了抑制致病性大腸桿菌和幽門螺旋桿菌的試驗，通過研究供試菌株對大腸桿菌均有抑制作用，抑制作用最強的為Q菌，抑菌圈直徑12.6mm，超過對照菌株BB-12的8mm。供試菌株大部分對幽門螺旋桿菌有抑制作用，抑制作用最強的為B菌，抑菌圈直徑13mm，其次為Q菌12.7mm，對照菌株BB-12為

3、9.8mm。 對分離的乳酸菌進行了體外粘附能力試驗，通過研究，供試菌株中對Caco-2細胞粘附能力最高的為A菌，其粘附平均值為18.7±5.92個/細胞，其次為Q菌12.9±2.74個/細胞，對照菌株BB-12為10.7±2.46個/細胞。先用乳酸菌粘附2h后，Q菌和E菌對大腸桿菌競爭粘附抑制力最強；先用大腸桿菌粘附2h，再用乳酸菌粘附，粘附數(shù)與空白大腸桿菌粘附數(shù)相差不大。 對分離的乳酸菌進行了抗氧化試驗，通過研究Q菌受

4、試品喂服小鼠8天使得SOD活力增強，MDA含量有所降低，具有一定的抗氧化能力。 在功能特性研究的基礎(chǔ)上，對篩選獲得的Q菌，進行初步鑒定。經(jīng)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察及代謝產(chǎn)物氣相色譜測定分析，Q菌歸屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)。通過API50CHL試驗條生理生化特性研究，鑒定Q菌99.9％為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMC

5、CNo.1531，中國專利申請?zhí)枮椋?00510111588.9，菌株名為鼠李糖乳桿菌LVl08。 在此基礎(chǔ)上，進一步利用分子生物學(xué)方法對鼠李糖乳桿菌LVl08進行了16SrRNA基因的擴增與測序，BLAST在線比對結(jié)果是：與菌株LactobacillusrhamnosusMCRF-412和LactobacillusrhamnosusMCRF-27116SrRNA的基因序列只相差一個堿基，同源性高達99.9％。與全球最著名的益生

6、菌LactobacillusrhamnosusGGATCC53103的16SrRNA只相差2個堿基，同源性高達99.9％。再將序列與乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrRNA基因序列作同源性分析，利用Clustalw軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌LV108與標(biāo)準(zhǔn)菌株LactobacillusrhamnosusATCC7469的同源性為99.4％。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹及16SrRNA的部分序列分析結(jié)果，可將鼠李糖乳桿菌LV108判定為1株鼠李糖

7、乳桿菌，這與生理生化等傳統(tǒng)分類鑒定方法所得結(jié)果完全一致。 為了篩選特異性的分子標(biāo)記，并在菌株水平上對鼠李糖乳桿菌更好地鑒定，首先對鼠李糖乳桿菌RAPD擴增體系進行了優(yōu)化，得出RAPD擴增體系：采用模板100ng，25mMMg2+3.5μL，Taq酶1U，200μMdNTPs，10pmo1隨機引物，反應(yīng)總體積為25μL。PCR擴增參數(shù)：94℃2min，1次循環(huán)；94℃1min，36℃1min，72℃2min，40次循環(huán)；72℃10

8、min結(jié)束。通過對20條隨機引物的篩選，本文篩選到了1條在菌株水平具有鑒別意義的隨機引物P4，序列為5'-CTGCGCTGGA-3'，并得到了可區(qū)分鼠李糖乳桿菌LV108與其他鼠李糖乳桿菌的DNA分子標(biāo)記，位于大約1500bp。 本文還對鼠李糖乳桿菌LV108的加工特性進行了初步的研究。通過研究顯示：鼠李糖乳桿菌LV108在37℃培養(yǎng)27h活菌數(shù)量達到最高，最高達到8×109cfu/mL；鼠李糖乳桿菌LV108具有良好的貯藏特性