鼠李糖乳酸桿菌培養(yǎng)上清液對慢加急性酒精性肝損傷小鼠的保護作用.pdf

1、背景和目的:
　　隨著經(jīng)濟發(fā)展和社交活動日益增多，人均酒精消耗在世界范圍內不斷增加，酒精性肝損傷患者數(shù)量呈上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計，有80％酗酒者表現(xiàn)出一定程度的酒精性肝損傷特征，10～35％可進展為酒精性肝炎，10～20％可進展為酒精性肝硬化。輕度的酒精性肝損傷在戒酒后可能被逆轉，但是嚴重的酒精性肝損傷可能導致酒精性肝硬化或誘發(fā)廣泛肝細胞壞死，最終造成肝功能衰竭，導致不可逆的生命危險。腸道屏障的損傷引起菌群移位、內毒素經(jīng)過腸道屏障吸收，

2、激活免疫應答，對酒精性肝損傷的發(fā)生發(fā)展起到重大影響。然而，目前針對酒精性肝損傷尚無特效治療藥物，尋求新的臨床治療藥物是亟待解決的問題。利用益生菌保護腸道屏障作用的研究中，目前對于鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)的研究較為深入，該菌種可降低腸道屏障通透性，減輕酒精性肝損傷，但是其確切的保護機制尚未闡明。本試驗通過在飲食中加入LGG培養(yǎng)上清液(LGG-s)，干預慢加急性酒精性肝損傷小鼠模型，檢測

3、小鼠外周血Th17細胞和Treg細胞數(shù)量的影響，以及IL-17蛋白表達水平的改變，并探討LGG-s發(fā)揮作用的可能機制。
　　方法:
　　1.LGG-s的制備:購買鼠李糖乳酸桿菌菌種，按照ATCC培養(yǎng)標準，接種于MRS培養(yǎng)基，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)菌種，按3％接種量接種。將鼠李糖乳酸桿菌培養(yǎng)至109U/ml菌落形成后，4℃、5000g/min的條件下離心10分鐘，上清液通過0.22-μm過濾器過濾菌體，收集上清液作為LG

4、G-s，儲存于4℃冰箱備用。
　　2.慢加急性酒精性肝損傷小鼠模型的建立:在本試驗中，我們采用10周齡的C57BL/6雄性小鼠，建立慢加急性酒精喂養(yǎng)小鼠模型，研究LGG-s在預防酒精性肝病中的作用及其機制。建模過程中，模型組小鼠以含5％酒精的Lieber-DeCali流質飲食飼養(yǎng)10日，在第11日上午給予1次大劑量(5g/kg體重)酒精灌胃。灌胃后第9小時，麻醉并處死小鼠。建模的全過程中，除流質飲食中的水分之外，保證小鼠不能接觸到

5、其它水源。
　　3.動物實驗:18只10周齡C57BL/6雄性小鼠，按每組6只隨機將小鼠分為3組，分別為模型組、對照組和治療組。對照組建模過程以等熱量的麥芽糖糊精代替模型組飲食中和灌胃所用的酒精，其余處理與模型組保持一致。治療組小鼠飲食在模型組飲食的基礎上加入LGG-s，保證每日小鼠進食中包含LGG-s超過1ml。所有實驗動物于灌胃后第9小時處死并采集血、小腸和肝臟標本。肝組織-80℃保存用于油紅O染色。經(jīng)修邊、固定、石蠟包埋的肝

6、組織用于制備石蠟切片HE染色。光學顯微鏡下觀察肝組織的炎癥變化和脂滴形成。收集回腸末端1.5cm腸組織，延長軸剖開，行HE染色，步驟同肝組織。全自動生化儀檢測各組小鼠生化指標丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)的變化。反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測腸組織中Occludin、Claudin-1、ZO-1的mR

7、NA表達情況。Western-Blot檢測各組小鼠肝組織大腸埃希菌菌體蛋白的含量。全血樣本流式細胞術檢測Th17和Treg細胞在CD4+T淋巴細胞中的比例。ELISA檢測血清中IL-17蛋白的表達水平。
　　4.計量資料用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示。統(tǒng)計學分析應用SPSS19.0對各組數(shù)據(jù)進行比較分析，P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.建立小鼠NIAAA(National Institute

8、 on Alcohol Abuse and Alcoholism，NIAAA)模型:11日建模過程后，小鼠肝功能異常在灌胃后第9小時達到的峰值，外周血血清檢測示ALT水平為150.30±40.84 U/L，AST水平為393.3±176.1 U/L，較對照組顯著升高，且肝組織病理HE染色和油紅O染色觀察到顯著的大脂滴形成和肝組織壞死。慢加急性酒精性肝損傷小鼠模型建模成功。
　　2.LGG-s對NIAAA模型治療效果觀察:模型組小鼠

9、平均血清ALT水平和AST水平較對照組（ALT:54.83±11.36U/L，AST:240.0±72.79U/L，P＜0.05）明顯升高，而LGG-s治療組血清ALT、AST(ALT:64.50±11.36U/L，AST:192.8±25.44U/L)較模型組均有明顯下降(P＜0.01)，三組差異有統(tǒng)計學意義(FALT=25.828，PALT＜0.01;FAST=5.354，PAST＜0.05)。對照組與治療組兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意

10、義。組織學觀察，AF組中可見大泡性脂肪變性，脂肪變性分布廣泛，而經(jīng)LGG-s治療后脂肪變性明顯減少，無壞死灶，但與正常對照組相比，仍有小泡性脂肪變性形成。檢測各組小腸組織中Claudin-1、Occludin、zonulaoccludens-1(ZO-1)的mRNA表達含量。模型組Claudin-1和ZO-1的轉錄水平較對照組顯著下降(P＜0.001)，LGG-s治療后有所恢復，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但是治療組較對照組轉錄水

11、平仍降低(P＜0.01)。但是治療組中Occludin的轉錄水平雖較模型組有所升高，然而并無統(tǒng)計學差異。Western blotting檢測肝組織中大腸埃希菌菌體蛋白表達量，對照組、模型組和治療組之間有統(tǒng)計學差異(F=47.429，P＜0.01)，兩兩比較，均有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。其變化趨勢與腸道緊密連接蛋白的變化相反。分離小鼠外周血單個核細胞，采用流式細胞術檢測Th17細胞和Treg細胞，模型組中Th17細胞比例較對照組升高，

12、治療組中下降，差異有統(tǒng)計學意義(F=15.841，P＜0.01);而Treg細胞比例在模型組中下降，治療后顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(F=25.192，P＜0.01)。ELISA檢測外周血中IL-17的蛋白表達在模型組（160.7±43.93pg/ml）較對照組（116.7±15.54pg/ml）明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，LGG-s治療后（115.1±9.877pg/ml）顯著下降。
　　結論:
　　1.L