成纖維細胞生長因子受體3在惡性黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究.pdf

1、惡性黑色素瘤是極具侵襲性的皮膚惡性腫瘤之一，多發(fā)于歐美等發(fā)達國家。在美國，惡性黑色素瘤分別是發(fā)病率第五的男性惡性腫瘤(5％)和發(fā)病率第六的女性惡性腫瘤(4％)。對于亞洲國家而言，惡性黑色素瘤的發(fā)病率遠遠低于歐美國家，大部分地區(qū)發(fā)病率不足1/10萬。在中國，惡性黑色素瘤并不是一種十分常見的惡性腫瘤，然而，由于人口基數(shù)大，惡性黑色素瘤的總體罹患人數(shù)較多，尤其在沿海發(fā)達城市，惡性黑色素瘤的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)快速上升趨勢，應引起足夠的重視。此

2、外，惡性黑色素瘤是一種早期轉移率極高的惡性腫瘤，預后很差，這也是該病致死率高的一個重要原因。惡性黑色素瘤病因復雜，目前已經(jīng)明確的惡性黑色素瘤致病因素有遺傳因素、日光暴露等環(huán)境因素以及電離輻射等因素。治療措施方面，臨床上以手術切除治療為主，輔以免疫療法、腫瘤靶向藥物治療等綜合措施，可改善大部分惡性黑色素瘤患者的疾病進程。然而，上述治療措施對于轉移性惡性黑色素瘤療效甚微，患者的五年生存率不足20％。因此，尋找新的診斷、治療手段對于提高惡性黑

3、色素瘤患者的預后具有重要意義。
　　成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）家族蛋白及其受體FGFR家族蛋白屬于經(jīng)典的酪氨酸激酶受體-配體信號通路轉導蛋白。目前共有22種FGF和4種FGFR被發(fā)現(xiàn)和鑒定。FGFR家族蛋白在機體正常的血管形成、胚胎發(fā)育等過程發(fā)揮重要作用。FGFR3最早被認為是一種骨骼發(fā)育的負向調控蛋白，F(xiàn)GFR3敲除的小鼠呈現(xiàn)長骨發(fā)育過度的表型，而激活的FGFR3突變則被證實與

4、侏儒癥密切相關。近年來，過度激活的FGFR3信號被證實與骨髓瘤、宮頸癌、膀胱癌等惡性腫瘤密切相關，激活型FGFR3突變可以顯著增強多種腫瘤細胞的惡性行為，因此FGFR3被認為是多種惡性腫瘤的一個潛在治療靶點。FGF及其受體與惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，F(xiàn)GFR1是決定惡性黑色素瘤原位增生、血管新生和遠處轉移的一個關鍵基因。FGFR4與惡性黑色素瘤的惡性程度正相關?？紤]到FGFR家族蛋白在結構上的同源性和功能上的相似性，闡明FGFR3

5、在惡性黑色素瘤中的表達情況、臨床意義和生物學功能可能具有重要的價值。
　　研究目的:
　　1、使用定量PCR技術明確FGFR3在惡性黑色素瘤組織和配對正常組織中的表達量。
　　2、檢測FGFR3在惡性黑色素瘤組織中的表達量與患者的臨床病理特點之間的關系。
　　3、分別在惡性黑色素瘤細胞中敲低和過表達FGFR3，驗證FGFR3對細胞增殖的調控作用。
　　4、驗證FGFR3對惡性黑色素瘤細胞的體外遷移、侵襲及上

6、皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)行為的調控作用。
　　5、探究FGFR3對惡性黑色素瘤細胞體內增殖、遷移的調控作用。
　　6、初步明確沉默F(xiàn)GFR3導致的惡性黑色素瘤細胞信號通路改變。
　　研究方法:
　　1、收集惡性黑色素瘤組織及其癌旁組織樣本42對，抽提RNA之后，采用熒光實時定量PCR技術(Quantitative Real-time PCR，qR

7、T-PCR)檢測FGFR3在惡性黑色素瘤組織和對應癌旁組織的表達量。
　　2、免疫組化芯片技術檢測FGFR3在惡性黑色素瘤組織中的表達量，根據(jù)染色強度和陽性細胞數(shù)進行評分。染色強度由低到高分為A、B、C、D四個等級，陽性細胞數(shù)分為A(＜10％)、B(10％-25％)、C(25％-50％)、D(＞50％)四個等級。采用染色強度的評分乘以陽性細胞數(shù)評分代表每個樣本最終的評分，0-3分代表FGFR3低表達，4-9代表高表達。
　　

8、3、采用慢病毒轉染技術獲得穩(wěn)定敲低FGFR3的細胞株A375/LV-shFGFR3和對照細胞株A375/LV-control。瞬時轉染技術獲得高表達FGFR3的細胞株A375/pcDNA3.0-FGFR3和對照細胞株A375/pcDNA3.0，采用qPCR技術分別驗證mRNA水平的敲低效率和過表達效率。
　　4、采用CCK-8技術檢測FGFR3對惡性黑色素瘤細胞增殖的調控作用。使用適量胰酶消化細胞后，用培養(yǎng)液重懸，反復吹打均勻，將

9、其濃度調整為1000細胞/100微升。各組細胞分別取100ul細胞懸液置于96孔板中，每天相同時刻加入10ul CCK-8，4h后使用酶標儀檢測吸光度值，連續(xù)檢測6天。
　　5、采用流式細胞術檢測FGFR3對惡性黑色素瘤細胞凋亡率的影響。A375/LV-shFGFR3和A375/LV-control細胞經(jīng)AnnexinⅤ和PI染色后，經(jīng)流式細胞儀檢測其凋亡率差異。
　　6、采用transwell小室和matrigel inv

10、asion chambers分別檢測FGFR3對惡性黑色素瘤細胞遷移、侵襲的調控作用。
　　7、A375/LV-shFGFR3和A375/LV-control細胞分別注射入4周齡裸鼠右側腋下，每周檢測腫瘤體積變化，5周后將裸鼠處死，對比兩組皮下移植瘤的大小和重量。兩組細胞分別經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內，兩個月后對比兩組裸鼠肺部轉移結節(jié)的數(shù)目。
　　8、采用Western blot技術檢測A375/LV-shFGFR33和A375

11、/LV-control細胞各自的ERK、AKT、EGFR等關鍵信號通路蛋白及其磷酸化蛋白的表達量。
　　研究結果:
　　1、FGFR3在惡性黑色素瘤組織中的表達量顯著高于癌旁組織。FGFR3在惡性黑色素瘤組織中的表達量與Breslow厚度和淋巴結轉移相關。
　　2、慢病毒干擾FGFR3的表達之后，A375細胞增殖活力降低，質粒過表達FGFR3之后，A375細胞的增殖活力升高。
　　3、沉默F(xiàn)GFR3顯著增加惡性黑

12、色素瘤細胞的凋亡率，過表達FGFR3降低其凋亡率。
　　4、慢病毒干擾FGFR3的表達之后，惡性黑色素瘤A375細胞的遷移、侵襲能力降低，而FGFR3表達質?？稍鰪姁盒院谏亓黾毎倪w移和侵襲能力。
　　5、沉默F(xiàn)GFR3可以顯著降低惡性黑色素瘤細胞的體內增殖、遷移能力。
　　6、沉默F(xiàn)GFR3增加上皮性標志物E-cadherin、Laminin的表達量，降低間充質標志物N-cadherin、vimentin等的表達量