應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的研究.pdf

1、本研究首先針對PRRSV中含量最高、相對保守的核衣殼蛋白(N)編碼序列ORF7基因，使用http：//www.ambion.com的靶位點(diǎn)篩選和設(shè)計(jì)工具，選取4個(gè)特異siRNA序列(siRNA95、siRNA179、siRNA218和siRNA294)，同時(shí)設(shè)計(jì)一個(gè)無相關(guān)序列(siRNA-C)對照，利用一步PCR法產(chǎn)生包含鼠U6啟動(dòng)子的發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA，shRNA)表達(dá)盒(shRNA95-PCR、shRNA17

2、9-PCR、shRNA218-PCR、shRNA294-PCR和shRNA-C-PCR)，帶shRNA表達(dá)盒的PCR產(chǎn)物分別與表達(dá)N蛋白的重組質(zhì)粒pEGFP-ORF7共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下檢測表達(dá)綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)細(xì)胞比例，快速篩選有效siRNA片段。篩選N-EGFP融合蛋白穩(wěn)定表達(dá)293T細(xì)胞系，驗(yàn)證了篩選片段的基因沉默效果，在PRRSV感染的MARC-145細(xì)胞中證明篩選

3、的siRNA片段可以明顯減輕PRRSV引起的特異性細(xì)胞病變。 為了使shRNA獲得長久表達(dá)并適合于大量制備，將PCR法制備shRNA表達(dá)盒插入到pEGFP-N1質(zhì)粒載體，構(gòu)建shRNA表達(dá)載體(pEN95-shRNA、pEN179-shRNA、pEN218-shRNA、pEN294-shRNA、pEC-shRNA)，轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，在mRNA水平及蛋白質(zhì)水平檢測shRNA表達(dá)載體對PRRSV復(fù)制的抑制。結(jié)果證明pEN1

4、79-shRNA可以明顯減輕PRRSV引起的特異性細(xì)胞病變；在間接免疫熒光分析(indirectimmunofluorescentassay，IFA)和Westernblot檢測中，pEN179-shRNA處理細(xì)胞的PRRSVN蛋白陽性細(xì)胞及N蛋白表達(dá)量比對照的明顯減少；熒光定量PCR(fluerenscencequantatitivePCR，F(xiàn)Q-PCR)和病毒滴定檢測發(fā)現(xiàn)pEN179-shRNA處理細(xì)胞中N蛋白的mRNA比對照減少了

5、96％，病毒滴度比對照減少了681倍。此外，pEN179-shRNA抑制效應(yīng)在一定范圍內(nèi)呈明顯的劑量依賴性。在檢測pEN179-shRNA抑制PRRSVORF7mRNA的同時(shí)，對次要結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA表達(dá)水平的變化進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，次要結(jié)構(gòu)蛋白GP2、GP3、GP4的mRNA表達(dá)水平分別比對照減少了60％、30％、55％，證明PRRSV的復(fù)制受到了抑制，而且pEN179-shRNA的抑制作用是特異的。 為了了解次要結(jié)構(gòu)蛋白GP

6、2、GP3、GP4在病毒復(fù)制中的作用，針對各基因分別選取4個(gè)siRNA位點(diǎn)，構(gòu)建相應(yīng)的shRNA表達(dá)載體(21、22、23、24、31、32、33、34、41、42、43、44)。FQ-PCR篩選可以減少PRRSV感染MARC-145細(xì)胞中ORF2、ORF3、ORF4相應(yīng)mRNA含量的特異shRNA表達(dá)載體，病毒效價(jià)滴定表明這些shRNA表達(dá)載體(23、24、31、34、41)處理細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒滴度比對照低4.65～184倍，但I(xiàn)