體外特異識別雙鏈DNA的TALEs設計合成與初步應用.pdf

1、目的：食源性致病菌污染是影響我國食品安全的最主要因素之一。本研究的總體目標旨在以大腸桿菌O157等食源性致病菌的特異雙鏈DNA為靶標分子，獲得高特異性雙鏈DNA結合蛋白，并為建立食源性致病菌快速檢測方法提供研究思路。分目標是利用生物信息學技術得到特異的靶標物質的DNA序列，建立特異的TALEs DNA模板，通過大腸桿菌系統(tǒng)翻譯，獲得特異的高親和力的DNA結合蛋白，并且嘗試建立可行的實驗室檢測方法，對TALEs體外識別的方法進行有效探索。

2、
　　方法：1、應用商業(yè)化產(chǎn)品與實驗室結合的方法，先根據(jù)目的DNA構建可用于體內基因組敲除的TALENs，然后通過測序以及生物信息學的其他技術排除重復序列眾多的干擾，尋找到完整的TALENs基因，再鑒定發(fā)揮識別DNA功能的TALEs，最后通過特異引物的設計采用PCR的方法獲得特異TALEs的基因；2、通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，建立pET-22b-TALEs表達載體。先對其進行小量的誘導表達，摸索實驗條件。當條件成熟后再對其進行大量

3、誘導表達，最后實現(xiàn)TALEs蛋白的高效可溶性表達；3、通過金屬螯合層析技術，利用6×His標簽可以與金屬離子鎳產(chǎn)生有生物選擇行的結合的特點，建立完備成熟的TALEs蛋白純化實驗室程序；4、通過凝膠阻滯和SPR的方法證明TALEs在體外環(huán)境下與DNA的結合能力；5、通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)將目標DNA連接到聚苯乙烯材料材料上，再通過TLAEs與DNA特異結合的原理，并對實驗條件進行一系列的探索優(yōu)化之后，初步實現(xiàn)基于ELISA的TALEs

4、檢測DNA的目的。
　　結果：1、成功的在獲得了TALEs蛋白的基因，長度約2100bp，并通過測序證明該序列正確可以正確翻譯；2、通過構建的表達載體，成功的實現(xiàn)了TALEs蛋白的大量可溶性表達，并通過蛋白純化獲得了純度較高的含有6×His標簽的目的蛋白；3、將生物素標記的雙鏈DNA結合在金片上，將目的蛋白稀釋不同的梯度，利用SPR技術證明了TALEs在體外環(huán)境中可以結合雙鏈DNA。4、當TALEs蛋白與完全匹配的DNA結合時，整

5、個DNA的分子量會變大，當DNA存在錯配時，這種結合就會減弱。因此采取了凝膠阻滯實驗，通過調整實驗條件在瓊脂糖凝膠電泳中再次得到了TALEs體外結合DNA的結果；5、探索了基于ELISA法的TALEs結合DNA的實驗，通過實驗條件的調整初步實現(xiàn)了采用ELISA法的思路對體外目的DNA特異性檢測的目的。并通過統(tǒng)計分析得到差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05），與其他實驗結果相互印證。
　　結論：1、通過適當理性設計，能夠在10天之內成功獲