基于雙鏈DNA生物傳感技術(shù)的DNA結(jié)合蛋白研究.pdf

1、序列特異性DNA結(jié)合蛋白在基因表達(dá)調(diào)控、DNA重組、限制性剪切及復(fù)制等細(xì)胞過程中發(fā)揮著極其重要的作用。生物傳感器技術(shù)具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在復(fù)雜的體系中進(jìn)行在線連續(xù)監(jiān)測，特別是其自動化、微型化與集成化的特點(diǎn)，受到人們的關(guān)注。納米金顆粒具有高靈敏、穩(wěn)定和生物兼容性的優(yōu)點(diǎn)，作為電化學(xué)標(biāo)記在生物分子相互作用檢測方面最近引起人們的注意。本文將納米金標(biāo)記技術(shù)、電化學(xué)傳感技術(shù)和生物芯片技術(shù)應(yīng)用于序列特異性DNA結(jié)合蛋白檢測，

2、主要包括三個研究方法。 1．納米金標(biāo)記電化學(xué)檢測DNA結(jié)合蛋白納米金顆粒作為電化學(xué)指示劑具有高靈敏、穩(wěn)定和生物兼容性等優(yōu)點(diǎn)。采用金標(biāo)銀染電化學(xué)法在電極和電解質(zhì)溶液界面上研究序列特異性DNA與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用至今未見報道。通過單分子發(fā)夾寡核苷酸固相延伸形成雙鏈寡核苷酸，以納米金顆粒標(biāo)記NF-κB并銀染放大，采用陽極溶出電位法對NF—κB進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，采用本方法檢測序列特異性蛋白質(zhì)的檢測下限為0．1pM，與常用的熒光法相比靈

3、敏度提高2個數(shù)量級。在NF-κB濃度1．5—60．0ng／L范圍內(nèi)具有線性關(guān)系。本方法具有高度特異性、高靈敏度、檢測快速等特點(diǎn)，為研究轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制、DNA的結(jié)構(gòu)域、功能蛋白檢測等研究提供了新的工具。 2．非標(biāo)記電化學(xué)檢測序列特異性DNA結(jié)合蛋白體外尤其固相反應(yīng)中蛋白質(zhì)的活性是影響轉(zhuǎn)錄因子與序列特異性DNA相互作用檢測的重要因素。鑒于常用的標(biāo)記方法繁瑣且易使蛋白質(zhì)失活，本研究發(fā)展了非標(biāo)記電化學(xué)法檢測序列特異性DNA結(jié)合蛋白質(zhì)

4、的方法。通用寡核昔酸與標(biāo)記靶寡核苷酸固相連接后在電極延伸形成雙鏈寡核苷酸，采用本法對NF—κB結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸突變進(jìn)行檢測。本方法具有高靈敏度和特異性的優(yōu)點(diǎn)。檢測下限為0．01pM，在NF—KB濃度0．5—20．0ng／L范圍內(nèi)具有線性關(guān)系，與常用的熒光法相比靈敏度提高3個數(shù)量級。 3．三維凝膠雙鏈DNA芯片檢測序列特異性DNA結(jié)合蛋白聚丙烯酰胺凝膠，能夠提供類似液相的穩(wěn)定環(huán)境，具有高結(jié)合容量和低熒光背景的優(yōu)點(diǎn)，適合于檢測生物大