基于雙鏈DNA生物傳感技術(shù)的DNA結(jié)合蛋白研究.pdf

1、序列特異性DNA結(jié)合蛋白在基因表達調(diào)控、DNA重組、限制性剪切及復制等細胞過程中發(fā)揮著極其重要的作用。生物傳感器技術(shù)具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在復雜的體系中進行在線連續(xù)監(jiān)測，特別是其自動化、微型化與集成化的特點，受到人們的關(guān)注。納米金顆粒具有高靈敏、穩(wěn)定和生物兼容性的優(yōu)點，作為電化學標記在生物分子相互作用檢測方面最近引起人們的注意。本文將納米金標記技術(shù)、電化學傳感技術(shù)和生物芯片技術(shù)應用于序列特異性DNA結(jié)合蛋白檢測，

2、主要包括三個研究方法。 1．納米金標記電化學檢測DNA結(jié)合蛋白納米金顆粒作為電化學指示劑具有高靈敏、穩(wěn)定和生物兼容性等優(yōu)點。采用金標銀染電化學法在電極和電解質(zhì)溶液界面上研究序列特異性DNA與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用至今未見報道。通過單分子發(fā)夾寡核苷酸固相延伸形成雙鏈寡核苷酸，以納米金顆粒標記NF-κB并銀染放大，采用陽極溶出電位法對NF—κB進行檢測。結(jié)果表明，采用本方法檢測序列特異性蛋白質(zhì)的檢測下限為0．1pM，與常用的熒光法相比靈

3、敏度提高2個數(shù)量級。在NF-κB濃度1．5—60．0ng／L范圍內(nèi)具有線性關(guān)系。本方法具有高度特異性、高靈敏度、檢測快速等特點，為研究轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機制、DNA的結(jié)構(gòu)域、功能蛋白檢測等研究提供了新的工具。 2．非標記電化學檢測序列特異性DNA結(jié)合蛋白體外尤其固相反應中蛋白質(zhì)的活性是影響轉(zhuǎn)錄因子與序列特異性DNA相互作用檢測的重要因素。鑒于常用的標記方法繁瑣且易使蛋白質(zhì)失活，本研究發(fā)展了非標記電化學法檢測序列特異性DNA結(jié)合蛋白質(zhì)

4、的方法。通用寡核昔酸與標記靶寡核苷酸固相連接后在電極延伸形成雙鏈寡核苷酸，采用本法對NF—κB結(jié)合位點單核苷酸突變進行檢測。本方法具有高靈敏度和特異性的優(yōu)點。檢測下限為0．01pM，在NF—KB濃度0．5—20．0ng／L范圍內(nèi)具有線性關(guān)系，與常用的熒光法相比靈敏度提高3個數(shù)量級。 3．三維凝膠雙鏈DNA芯片檢測序列特異性DNA結(jié)合蛋白聚丙烯酰胺凝膠，能夠提供類似液相的穩(wěn)定環(huán)境，具有高結(jié)合容量和低熒光背景的優(yōu)點，適合于檢測生物大