產(chǎn)酶溶桿菌C3菌株多環(huán)四胺酸大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物的分離與抗真菌作用機制研究.pdf

1、隨著放射療法、化學療法、免疫抑制劑、抗生素和內(nèi)置醫(yī)療器械的廣泛應用，導致了發(fā)生嚴重的感染，尤其是真菌感染。其中，白色念珠菌在免疫低下的病人體內(nèi)成為最易感染的真菌，也是許多重大疾病導致死亡的直接原因。治療白色念珠菌感染需要長期大量地使用藥物，導致耐藥菌不斷出現(xiàn)，加劇了臨床治療的難度。發(fā)現(xiàn)新結構和新作用機制的抗真菌藥物，是控制白色念珠菌感染的重要途徑。
　　具有活性的化合物大部分來源于微生物。長期以來人們主要關注革蘭氏陽性菌和真菌來源

2、的活性天然產(chǎn)物，而革蘭氏陰性細菌蘊藏的豐富天然產(chǎn)物資源沒有得到應有的關注。近些年人們對溶桿菌的開發(fā)，得到了系列結構新穎的活性化合物，溶桿菌正成為活性天然產(chǎn)物的新資源。本學位論文對產(chǎn)酶溶桿菌C3菌株的發(fā)酵條件進行篩選，在其次級代謝產(chǎn)物中分離得到了4個多環(huán)四胺酸大環(huán)內(nèi)酰胺(PTM)類化合物;開展了2個PTM類化合物的體內(nèi)外抗真菌活性評價，探討了其抗真菌的作用機制。
　　本論文第一章概述了當前真菌感染的嚴重性和臨床抗真菌藥物品種的匱乏。

3、實際上，目前臨床抗真菌藥物的作用靶點主要集中在細胞壁和細胞膜，并且導致大量耐藥菌株的出現(xiàn)。從新資源溶桿菌中尋找新穎的抗真菌化合物，是一條行之有效的途徑。本章綜述了溶桿菌活性天然產(chǎn)物及其生物活性和生物合成的研究現(xiàn)狀。
　　本論文第二章是產(chǎn)酶溶桿菌C3菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化，對該菌株中得到的代謝產(chǎn)物進行了結構鑒定。產(chǎn)酶溶桿菌C3菌株的平板發(fā)酵培養(yǎng)基篩選結果表明，C3菌株在TSB培養(yǎng)基中次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量最高。同時我們對TSB的用量進行

4、考察，發(fā)現(xiàn)隨著TSB用量的減少，在C3菌株中得到的產(chǎn)物的量也相應降低。最終我們選用1/10 TSB培養(yǎng)基進行大規(guī)模發(fā)酵，得到4個PTM類化合物。其中，3個已知化合物（HSAF、3-deOH-HSAF和3-deOH-alteramide B）和1個新化合物alteramide B(ATB)。
　　本論文第三章是HSAF抑制絲狀真菌和白色念珠菌的活性研究。首先以水稻稻瘟病菌為研究模型，進行轉(zhuǎn)錄組差異分析，發(fā)現(xiàn)HSAF對細胞的凋亡途徑有

5、重要影響。由于細胞壁具有成分比較復雜的外層和結構比較致密的內(nèi)層結構，能夠影響小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)。我們研究在給藥過程中小分子藥物對于細胞各組分起到的作用及其作用機制，其中首要的是獲得原生質(zhì)體，進而以白色念珠菌為模型，在原生質(zhì)體水平，考察了HSAF作用方式。利用DCFH-DA熒光染色，檢測HSAF作用后細胞內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平。加入四種活性氧清除劑:抗壞血酸(AA)、硫脲(TU)、乙

6、酰半胱氨酸(NAC)和谷胱甘肽(GSH)后，HSAF的抗真菌活性明顯降低，表明HSAF通過誘導細胞內(nèi)ROS上調(diào)抑制真菌生長。通過熒光倒置顯微鏡、流式細胞分析儀和westernblotting等檢測，發(fā)現(xiàn)HSAF引起線粒體膜發(fā)生變化，其電位呈現(xiàn)出下降的趨勢，引起DNA損傷和細胞周期分布異常，停留在G2/M期，最終導致細胞發(fā)生早期和晚期凋亡。
　　本論文第四章是新化合物ATB抗白色念珠菌的作用機制研究。ATB對白念珠菌的體外抑制較好，

7、不僅能抑制白念珠菌酵母態(tài)的生長，也能抑制其菌絲體的生長。ATB能夠誘導白色念珠菌細胞內(nèi)ROS水平的上升，引起細胞內(nèi)線粒體膜電位的下降。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ATB能夠引起白色念珠菌細胞G2/M期停滯，導致細胞發(fā)生早期和晚期凋亡。AA可以抑制ATB對白色念珠菌細胞的生長周期阻滯和凋亡誘導作用，因此，ATB通過誘導白色念珠菌細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和積累而發(fā)揮其抗真菌活性。作用靶點研究結果表明，在HeLa細胞中，ATB能夠與微管蛋白結合;在體外，ATB

8、能夠抑制微管蛋白的聚集;分子模擬表明，ATB能與白色念珠菌β-tubulin的12個關鍵氨基酸相互作用;點突變實驗結果證明，ATB與β-tubulin的可能結合位點分別為L215、L217、L273、T274和R282，其中R282是關鍵作用位點。小鼠體內(nèi)實驗結果表明，ATB發(fā)揮了良好的體內(nèi)抑制白色念珠菌的作用。
　　本論文研究發(fā)現(xiàn)了新化合物ATB，探討了其抗真菌作用靶點和作用機制，首次發(fā)現(xiàn)微管蛋白有望成為抗真菌藥物的新靶點，為臨