閉塞性血管病中血管緊張素Ⅱ受體與內(nèi)皮素-1受體結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)突變的研究.pdf

1、目的：閉塞性血管病是一種常見的周圍血管慢性閉塞性炎癥病變，在器官移植性血管病、肺動(dòng)脈高壓、系統(tǒng)性硬化病的病理過程中均有表現(xiàn)。研究已經(jīng)表明，血管緊張素 II受體與內(nèi)皮素-1受體在閉塞性血管病的病理進(jìn)程中起到關(guān)鍵性作用。同時(shí)，同樣作為G蛋白偶聯(lián)受體，血管緊張素 II受體與內(nèi)皮素-1受體的胞外環(huán)結(jié)構(gòu)在受體激活過程中扮演著重要角色。血管緊張素II1型（Angiotensin II type1）和內(nèi)皮素-1 A型（Endothelin-1 typ

2、e A）受體的抗體被認(rèn)為是免疫介導(dǎo)的閉塞性血管病，如移植排斥反應(yīng)（graft rejection）和系統(tǒng)性硬化癥（SSC）的自身抗體，這些抗體可誘發(fā)強(qiáng)效且長(zhǎng)期的內(nèi)源性配體激活過程。AT1R和ETAR兩種受體有著高度相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這提示在免疫和內(nèi)源性刺激作用于這兩種受體時(shí)，很可能存在著不同的作用位點(diǎn)。為了進(jìn)一步研究。AT1R和ETAR兩種受體的單獨(dú)和相互作用機(jī)制，我們將建立一種基于基因工程酵母菌的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）激活分析模型，

3、在這一模型上，AT1R和ETAR兩種受體可獲得獨(dú)立的表達(dá)。我們將以此為基礎(chǔ)研究免疫刺激對(duì)其受體結(jié)構(gòu)的影響。我們將利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)這兩種受體胞外第二個(gè)環(huán)（second extracellular loop，ECL2）結(jié)構(gòu)進(jìn)行置換，并使用移植術(shù)后患者的血清IgG和內(nèi)源性配體對(duì)突變型受體進(jìn)行刺激，以研究免疫和內(nèi)源性刺激對(duì)受體結(jié)構(gòu)和功能的影響。
　　方法：以基因定點(diǎn)突變技術(shù)為基礎(chǔ)，利用基因擴(kuò)增技術(shù)來實(shí)現(xiàn)對(duì)于血管緊張素 II受體與內(nèi)皮

4、素-1受體胞外第2個(gè)環(huán)的誘導(dǎo)突變，突變后將實(shí)現(xiàn)血管緊張素II受體與內(nèi)皮素-1受體胞外第2個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)的互換。將突變后的受體基因序列轉(zhuǎn)化入細(xì)菌中進(jìn)行選擇性增殖，獲得大量攜帶有突變型受體基因序列的線性質(zhì)粒，以這些質(zhì)粒為載體，轉(zhuǎn)化基因工程酵母菌，建立針對(duì)突變型血管緊張素 II受體與內(nèi)皮素-1受體的真核細(xì)胞分析系模型。利用對(duì)應(yīng)的血管活性肽以及心臟移植術(shù)后患者的血清IgG，對(duì)酵母菌模型施加刺激，檢測(cè)酵母菌生長(zhǎng)情況以得出突變型受體對(duì)于刺激的相應(yīng)激活情況

5、并分析。
　　結(jié)果：對(duì)于血管緊張素II和患者血清IgG的刺激，野生型血管緊張素 II受體表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，而經(jīng)過胞外第2個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)互換的突變型的血管緊張素 II受體，在血管緊張素II和患者血清IgG的刺激下，并未表現(xiàn)出相應(yīng)的劑量依賴性。對(duì)于內(nèi)皮素-1和患者血清IgG的刺激，無論野生型內(nèi)皮素-1受體還是突變型內(nèi)皮素-1受體，均表現(xiàn)出了顯著地劑量依賴性。
　　結(jié)論：在心臟移植術(shù)后患者免疫介導(dǎo)的移植物血管?。╰ransplan