一氧化氮與胰島素抵抗大鼠腦細胞凋亡間的關系.pdf

1、研究背景:隨著醫(yī)療技術的進步、生育率的下降，我國已步入老齡化社會，腦血管疾病、腦神經(jīng)退行性病變的發(fā)生率逐年升高。腦血管疾病在我國已處于首位致死原因，給個人、家庭及社會帶來了沉重的負擔。而合并有代謝綜合征（Metabolic Syndrome,MS）的人群逐年增加。MS是多種代謝因素發(fā)生異常，聚集于同一個體的臨床綜合征，易并發(fā)糖尿病及心腦血管疾病。它的發(fā)病率在中國已經(jīng)超過14％。
　　研究發(fā)現(xiàn)，腦血管意外、神經(jīng)退行性病變、急性腦損傷

2、及癲癇等均存在神經(jīng)細胞凋亡（apoptosis）現(xiàn)象。致凋亡因素有很多種，體內外研究發(fā)現(xiàn)，過多的一氧化氮也是其中一種致凋亡因子。單硝酸異山梨酯，作為一種外源性一氧化氮供體，廣泛應用于合并有代謝綜合征的心血管疾病患者。但它是否有促進大腦細胞凋亡作用及其機制尚不清楚。
　　本實驗用Wistar大鼠模型，利用單硝酸異山梨酯作為一氧化氮供體，觀察大鼠腦細胞凋亡情況，檢測腦細胞凋亡基因、抗凋亡基因及其蛋白的表達情況，從分子水平上探討單硝酸異

3、山梨酯是如何促進合并有胰島素抵抗（insulin resistance,IR）大鼠的腦細胞凋亡的，并幫助尋找有效作用靶點，為治療與腦細胞凋亡有關疾病提供了一條新的途徑。
　　材料和方法:
　　1.分組及飼喂方法
　　14周齡Wistar雄性大鼠40只，體質量（393.75±11.09）g，各組大鼠之間體重差異無統(tǒng)計學意義。適應性喂養(yǎng)7天后，隨機分為4組，每組10只，分別飼喂普通飼料（對照組，Control組），高脂高糖

4、飲食(HFHG組)，普通飼料和單硝酸異山梨酯（ISMN組），以及同時給予HFHG和ISMN（聯(lián)合喂養(yǎng)組，UNITED組）。其中，ISMN按4.2mg/Kg劑量灌胃,不給予ISMN的大鼠使用生理鹽水灌胃。HFHG配方為：普通飼料79％，蔗糖10%，豬油5％，膽固醇5％，石膽酸1%。上述方法喂養(yǎng)12周。
　　2.觀察指標
　　（1）血標本用于檢測血糖濃度（葡萄糖氧化酶法）及胰島素含量（放射免疫法），以此計算胰島素抵抗指數(shù)。

5、>　?。?）采用硝酸還原酶法測定腦組織NO及iNOS含量。
　?。?）RT-PCR檢測方法測定Bcl-2、Bax mRNA表達含量，Western blot檢測方法測定Bcl-2、Bax蛋白表達含量。
　　（4）TUNEL法觀察放入4%甲醛溶液中腦組織形態(tài)及凋亡細胞的數(shù)量。
　　結果:
　　1.HOMA-IR與Control組大鼠相比，添加單硝酸異山梨酯飲食、高脂高糖飲食大鼠及聯(lián)合飲食大鼠HOMA-IR均升高，差

6、異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（表1）
　　2.腦組織中NO含量
　　與Control組大鼠相比，HFHG組、ISMN組及UNITED組大鼠NO含量均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；UNITED組大鼠NO含量高于HFHG組、ISMN組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（表2）
　　3.腦組織中iNOS含量
　　與Control組大鼠相比，ISMN組、HFHG組及UNITED組大鼠iNOS含量均升高

7、，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；UNITED組大鼠iNOS含量高于HFHG組、ISMN組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（表3）
　　4.HOMA-IR與NO含量的相關性分析
　　HFHG組大鼠組，NO含量與HOMA-IR呈正相關，r＝0.739，P<0.05。ISMN大鼠組，HOMA-IR與腦組織NO含量與呈顯著正相關，r＝0.922，P<0.01。（圖1）
　　5.各組大鼠腦細胞凋亡指數(shù)和腦組織形態(tài)學觀

8、察
　　TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒檢測腦細胞凋亡光鏡下可以觀察到處于凋亡狀態(tài)的細胞細胞核呈棕黃色，而正常的細胞細胞核不被染色。4組大鼠腦細胞均能觀察到部分凋亡細胞，而ISMN組、HFHG組及UNITED組大鼠腦細胞凋亡增多，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05。（表4、圖2）
　　6.各組大鼠腦組織Bcl-2、Bax mRNA與蛋白表達
　　與Control組大鼠相比，ISMN組、HFHG組及UNITED組大鼠Bcl-2

9、mRNA表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與Control組大鼠相比，ISMN組、HFHG組及UNITED組大鼠Bax mRNA表達水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（表5、圖3）
　　與Control組大鼠相比，ISMN組、HFHG組及UNITED組大鼠Bcl-2 mRNA蛋白表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與Control組大鼠相比，ISMN組、HFHG組及UNITED組大鼠Bax