NADPH氧化酶4對A549細胞遷移的影響.pdf

1、背景:肺癌是目前中國乃至全世界發(fā)病率和死亡率最高的癌癥，無數(shù)科研人員致力于研究肺癌的預防和治療。研究表明在肺癌細胞中NOX（NADPH氧化酶）家族中的NOX1和NOX4表達升高。NOX家族是機體內(nèi)產(chǎn)生活性氧（ROS）的主要來源，在很多腫瘤發(fā)生過程中均伴有ROS水平產(chǎn)生的變化，如：胰腺癌，大腸癌，非小細胞肺癌等。NOX家族在腫瘤的發(fā)生過程中起著重要作用，其中NOX4可能參與腫瘤細胞的轉移過程，而造成肺癌病人死亡的主要原因是肺癌的轉移。因此

2、研究NOX4對A549細胞遷移的影響對肺癌的機制研究具有重要意義。
　　上皮間充質轉化（EMT）是上皮細胞在形態(tài)學上發(fā)生向間充質細胞轉變，并獲得遷移的能力，EMT是胚胎發(fā)育的一個基本過程，它使在特殊部位產(chǎn)生的上皮細胞從上皮組織分離并轉化到其他的組織上，是正常發(fā)育、傷口愈合和惡性腫瘤發(fā)生的基礎。在腫瘤的惡性轉變進程中，EMT使得腫瘤細胞獲得了遷移和惡變的能力，在各個病理分期的腫瘤細胞均可見到EMT過程。其中TGF-β是腫瘤細胞發(fā)生E

3、MT過程的重要調(diào)節(jié)因子，同時 TGF-β可通過 NADPH氧化酶產(chǎn)生 ROS，而 ROS在細胞內(nèi)的積累對于TGF-β信號傳導通路又能起到調(diào)節(jié)作用。
　　為了探討NOX4是否通過TGF-β介導的EMT影響A549細胞的遷移，為肺癌的靶向治療提供理論基礎，實驗首先采用不同濃度的TGF-β刺激A549細胞，觀察細胞內(nèi)ROS水平的變化及細胞內(nèi)NOX表達的變化，并用劃痕實驗觀察A549細胞遷移的變化。再采用DPI抑制NOX的表達，同時TGF

4、-β刺激A549細胞，觀察觀察細胞內(nèi)ROS水平和NOX表達變化以及細胞的遷移的變化，同時western blot檢測EMT相關蛋白snail和E-cadherin的變化。
　　方法:
　　1.實驗方法
　　1.1實驗分組：TGF-β刺激濃度選擇：分別設置TGF-β刺激濃度為1、0ng/ml；2、2.5ng/ml；3、5ng/ml；4、10ng/ml。然后選擇一個合適的TGF-β濃度刺激A549細胞，實驗分組如下：1、T

5、GF-β刺激組；2、正常對照組（空白對照）；3、DPI組（NOX抑制劑組）；4、TGF-β+DPI組；5、DMSO組（溶劑對照組）。
　　1.2 A549細胞遷移的改變，采用細胞劃痕實驗來檢測，根據(jù)細胞劃痕實驗的愈合率來表示細胞的遷移率。
　　1.3細胞內(nèi)ROS的測定：細胞相應處理24h后，用DCFH-DA標記20min，然后用流式細胞儀檢測ROS表達的熒光值，根據(jù)熒光值的強弱表示ROS表達水平的高低。
　　1.4 m

6、RNA水平的檢測，提取出細胞內(nèi)的RNA后用微量核酸測定儀檢測RNA純度、瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性后，逆轉錄為cDNA進行PCR或熒光定量PCR。
　　1.5 NOX1、NOX4、snail、E-cadherin蛋白水平的檢測：將提取的蛋白質檢測其濃度和純度后，采用western blot方法檢測蛋白表達水平。
　　2.統(tǒng)計方法：采用SPSS21.0對實驗結果數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析比較三組的均數(shù)之間的差

7、異，兩兩比較采用LSD法或Dunnett法。兩變量關聯(lián)性分析選取檢測Pearson相關系數(shù)，檢驗水準取α=0.05。
　　結果:
　　1.不同濃度的TGF-β刺激A549細胞，隨著TGF-β濃度的升高，劃痕實驗的愈合率增高，A549細胞的遷移能力增強。流式細胞儀檢測ROS的熒光量升高，說明細胞內(nèi)ROS表達水平上升；與NOX1相比NOX4蛋白的mRNA和蛋白的表達水平均升高，且NOX4的表達與ROS水平升高趨勢相同。
　

8、　2.加入NOX4抑制劑DPI后，DPI組組正常對照組相比NOX4mRNA和蛋白表達水平均明顯下降，統(tǒng)計學檢測差異具有統(tǒng)計學意義；TGF-β+DPI組與TGF-β組相比NOX4mRNA和蛋白表達水平也均明顯下降，統(tǒng)計學檢測差異具有統(tǒng)計學意義，說明DPI成功的抑制了A549細胞內(nèi)NOX4的表達。
　　3. NOX4被抑制后，正常對照組與DMSO組相比無差異，統(tǒng)計分析差異無統(tǒng)計學意義；DPI組與正常對照組相比，TGF-β+DPI組與T

9、GF-β組相比，ROS水平明顯降低，統(tǒng)計結果顯示差異有統(tǒng)計學意義。
　　4.劃痕結果顯示，DPI組與正常對照組相比，TGF-β+DPI組與TGF-β組相比，劃痕愈合率降低，說明DPI可以抑制由TGF-β誘導的A549細胞的遷移。5.snail和E-cadherin蛋白的變化：DMSO組和正常對照組無差異，TGF-β組與DMSO組相比，snail表達上升，E-cadherin表達下降；DPI組與DMSO組相比，TGF-β+DPI組與

10、TGF-β組相比，snail表達降低，E-cadherin表達升高。
　　6.細胞形態(tài)學顯示，正常對照組和DMSO組相比形態(tài)學無差異，TGF-β組刺激的細胞形態(tài)學上相比正常對照組和DMSO組細胞間粘連變低，細胞變的更加的細長，趨向于間充質細胞的形態(tài)，而加入 TGF-β+DPI后的A549細胞和TGF-β組相比細胞的形態(tài)，由TGF-β刺激誘發(fā)的細胞形態(tài)的變化不再明顯
　　結論:NOX4可以通過EMT途徑促進A549細胞的遷移，