NADPH氧化酶4對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響.pdf

1、背景:肺癌是目前中國(guó)乃至全世界發(fā)病率和死亡率最高的癌癥，無(wú)數(shù)科研人員致力于研究肺癌的預(yù)防和治療。研究表明在肺癌細(xì)胞中NOX（NADPH氧化酶）家族中的NOX1和NOX4表達(dá)升高。NOX家族是機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生活性氧（ROS）的主要來(lái)源，在很多腫瘤發(fā)生過(guò)程中均伴有ROS水平產(chǎn)生的變化，如：胰腺癌，大腸癌，非小細(xì)胞肺癌等。NOX家族在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起著重要作用，其中NOX4可能參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程，而造成肺癌病人死亡的主要原因是肺癌的轉(zhuǎn)移。因此

2、研究NOX4對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響對(duì)肺癌的機(jī)制研究具有重要意義。
　　上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，并獲得遷移的能力，EMT是胚胎發(fā)育的一個(gè)基本過(guò)程，它使在特殊部位產(chǎn)生的上皮細(xì)胞從上皮組織分離并轉(zhuǎn)化到其他的組織上，是正常發(fā)育、傷口愈合和惡性腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)。在腫瘤的惡性轉(zhuǎn)變進(jìn)程中，EMT使得腫瘤細(xì)胞獲得了遷移和惡變的能力，在各個(gè)病理分期的腫瘤細(xì)胞均可見到EMT過(guò)程。其中TGF-β是腫瘤細(xì)胞發(fā)生E

3、MT過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子，同時(shí) TGF-β可通過(guò) NADPH氧化酶產(chǎn)生 ROS，而 ROS在細(xì)胞內(nèi)的積累對(duì)于TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路又能起到調(diào)節(jié)作用。
　　為了探討NOX4是否通過(guò)TGF-β介導(dǎo)的EMT影響A549細(xì)胞的遷移，為肺癌的靶向治療提供理論基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)首先采用不同濃度的TGF-β刺激A549細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化及細(xì)胞內(nèi)NOX表達(dá)的變化，并用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察A549細(xì)胞遷移的變化。再采用DPI抑制NOX的表達(dá)，同時(shí)TGF

4、-β刺激A549細(xì)胞，觀察觀察細(xì)胞內(nèi)ROS水平和NOX表達(dá)變化以及細(xì)胞的遷移的變化，同時(shí)western blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白snail和E-cadherin的變化。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)方法
　　1.1實(shí)驗(yàn)分組：TGF-β刺激濃度選擇：分別設(shè)置TGF-β刺激濃度為1、0ng/ml；2、2.5ng/ml；3、5ng/ml；4、10ng/ml。然后選擇一個(gè)合適的TGF-β濃度刺激A549細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組如下：1、T

5、GF-β刺激組；2、正常對(duì)照組（空白對(duì)照）；3、DPI組（NOX抑制劑組）；4、TGF-β+DPI組；5、DMSO組（溶劑對(duì)照組）。
　　1.2 A549細(xì)胞遷移的改變，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)，根據(jù)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的愈合率來(lái)表示細(xì)胞的遷移率。
　　1.3細(xì)胞內(nèi)ROS的測(cè)定：細(xì)胞相應(yīng)處理24h后，用DCFH-DA標(biāo)記20min，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS表達(dá)的熒光值，根據(jù)熒光值的強(qiáng)弱表示ROS表達(dá)水平的高低。
　　1.4 m

6、RNA水平的檢測(cè)，提取出細(xì)胞內(nèi)的RNA后用微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR或熒光定量PCR。
　　1.5 NOX1、NOX4、snail、E-cadherin蛋白水平的檢測(cè)：將提取的蛋白質(zhì)檢測(cè)其濃度和純度后，采用western blot方法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。
　　2.統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS21.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析比較三組的均數(shù)之間的差

7、異，兩兩比較采用LSD法或Dunnett法。兩變量關(guān)聯(lián)性分析選取檢測(cè)Pearson相關(guān)系數(shù)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.不同濃度的TGF-β刺激A549細(xì)胞，隨著TGF-β濃度的升高，劃痕實(shí)驗(yàn)的愈合率增高，A549細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS的熒光量升高，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平上升；與NOX1相比NOX4蛋白的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均升高，且NOX4的表達(dá)與ROS水平升高趨勢(shì)相同。
　

8、　2.加入NOX4抑制劑DPI后，DPI組組正常對(duì)照組相比NOX4mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TGF-β+DPI組與TGF-β組相比NOX4mRNA和蛋白表達(dá)水平也均明顯下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明DPI成功的抑制了A549細(xì)胞內(nèi)NOX4的表達(dá)。
　　3. NOX4被抑制后，正常對(duì)照組與DMSO組相比無(wú)差異，統(tǒng)計(jì)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DPI組與正常對(duì)照組相比，TGF-β+DPI組與T

9、GF-β組相比，ROS水平明顯降低，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.劃痕結(jié)果顯示，DPI組與正常對(duì)照組相比，TGF-β+DPI組與TGF-β組相比，劃痕愈合率降低，說(shuō)明DPI可以抑制由TGF-β誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的遷移。5.snail和E-cadherin蛋白的變化：DMSO組和正常對(duì)照組無(wú)差異，TGF-β組與DMSO組相比，snail表達(dá)上升，E-cadherin表達(dá)下降；DPI組與DMSO組相比，TGF-β+DPI組與

10、TGF-β組相比，snail表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)升高。
　　6.細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯示，正常對(duì)照組和DMSO組相比形態(tài)學(xué)無(wú)差異，TGF-β組刺激的細(xì)胞形態(tài)學(xué)上相比正常對(duì)照組和DMSO組細(xì)胞間粘連變低，細(xì)胞變的更加的細(xì)長(zhǎng)，趨向于間充質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，而加入 TGF-β+DPI后的A549細(xì)胞和TGF-β組相比細(xì)胞的形態(tài)，由TGF-β刺激誘發(fā)的細(xì)胞形態(tài)的變化不再明顯
　　結(jié)論:NOX4可以通過(guò)EMT途徑促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移，