晚期氧化蛋白產(chǎn)物通過NADPH氧化酶途徑誘導(dǎo)大鼠胰島β細(xì)胞凋亡.pdf

1、本研究擬以體外培養(yǎng)的大鼠胰島β細(xì)胞株INS-1為細(xì)胞模型，觀察氧化修飾的大鼠白蛋白（AOPP）對(duì)胰島β細(xì)胞的影響，并探討其可能的機(jī)制。 方法: 以體外培養(yǎng)的大鼠胰島細(xì)胞瘤來源的β細(xì)胞系INS-1為細(xì)胞模型，觀察AOPP對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡的影響及其可能機(jī)制。 1.無內(nèi)毒素AOPP的制備與鑒定。 用GUO ZJ等介紹的方法體外制備AOPP。將20mg/ml無內(nèi)毒素大鼠血清白蛋白溶液與40mmol/l次氯酸等體積混合

2、，室溫放置30分鐘，制備出RSA與次氯酸摩爾比1：140的AOPP。制備的AOPP在無內(nèi)毒素PBS中透析24小時(shí)，以除去游離次氯酸。用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后4℃保存。20mg/mlRSA與PBS等體積混合，作為對(duì)照。AOPP含量通過測(cè)定酸性條件下340nm的吸光度值，以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn)取得。制備的AOPP-RSA和未經(jīng)修飾的RSA用鱟試驗(yàn)法檢測(cè)內(nèi)毒素的含量。 2.INS-1細(xì)胞的培養(yǎng)。 INS-1細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI

3、-1640培養(yǎng)基，置于5% CO2/95%空氣的37℃孵箱中培養(yǎng)，每3天換液一次，每周按1：3傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞活力的檢測(cè)用臺(tái)盼藍(lán)染色。在加入刺激物質(zhì)之前，用含0.1%BSA的RPMI1640培養(yǎng)液孵育24小時(shí)，使細(xì)胞同步生長(zhǎng)。 3.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。 3.1 熒光TUNEL： INS-1細(xì)胞接種于蓋玻片上，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合，用含0.1%BSA的RPMI1640培養(yǎng)液孵育24小時(shí)，使

4、細(xì)胞同步生長(zhǎng)。取同步生長(zhǎng)的細(xì)胞分別與400μg/ml AOPP或400μg/ml未經(jīng)修飾的RSA孵育48小時(shí)，以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，按照試劑盒說明，進(jìn)行熒光TUNEL和Hochest 33258染色。 3.2 透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡： INS-1細(xì)胞分別與400μg/ml AOPP或400pg/ml未經(jīng)修飾的RSA孵育48小時(shí)，以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，消化收集細(xì)胞，置離心管中離心，800-1000

5、r/min，10min，PBS清洗，加入2.5%戊二醛預(yù)固定。再用1%鋨酸磷酸緩沖液固定1-2小時(shí)，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片，醋酸枸椽酸鉛染色，透射電鏡觀察。 3.3 Annexin Ⅴ-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡： INS-1細(xì)胞與400μg/ml AOPP共同孵育6、12、24、48小時(shí)，以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，按照試劑盒說明流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，激發(fā)光波長(zhǎng)用488nm，用一波長(zhǎng)為5

6、15nm的通帶濾器檢測(cè)FITC熒光，另一波長(zhǎng)大于560nm的濾器檢測(cè)PI。觀察AOPP誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡的時(shí)間效應(yīng)。 INS-1細(xì)胞分別與50、100、200、400μg/ml AOPP或400μg/ml未經(jīng)修飾的RSA共同孵育48小時(shí)，以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，按照試劑盒說明流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，觀察AOPP誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡的劑量效應(yīng)。 4.細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA和蛋白的檢測(cè)。

7、 4.1 INS-1細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白的檢測(cè)： INS-1細(xì)胞與400Ⅴg/ml AOPP共同孵育6、12、24、48小時(shí)，以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，提取細(xì)胞總RNA和蛋白，按試劑盒說明進(jìn)行操作，實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blotting檢測(cè)AOPP對(duì)Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)變化的時(shí)間效應(yīng)。 INS-1細(xì)胞分別與50、100、200、400μg/ml AOPP或400μg/ml未經(jīng)修飾的

8、RSA共同孵育48小時(shí)，以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA和蛋白，實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blotting檢測(cè)AOPP對(duì)Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)變化的劑量效應(yīng)。 4.2 INS-1細(xì)胞Bax mRNA和蛋白的檢測(cè)： 取同步生長(zhǎng)的INS-1細(xì)胞與400μg/ml AOPP共同孵育6、12、24、48小時(shí)，以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，提取細(xì)胞總RNA和蛋白，按試劑盒說明進(jìn)行操作

9、，實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blotting檢測(cè)AOPP對(duì)Bax mRNA和蛋白表達(dá)變化的時(shí)間效應(yīng)。 取同步生長(zhǎng)的INS-1細(xì)胞分別與50、100、200、400μg/ml AOPP或400μg/ml未經(jīng)修飾的RSA共同孵育48小時(shí)，以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA和蛋白，實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blotting檢測(cè)AOPP對(duì)BaxmRNA和蛋白表達(dá)變化的劑量效應(yīng)。 5.INS

10、-1細(xì)胞Caspase-3片斷蛋白的檢測(cè)。 取同步生長(zhǎng)的INS-1細(xì)胞與400μg/ml AOPP共同孵育6、12、24、48小時(shí)，以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，提取細(xì)胞總蛋白，Western Blotting檢測(cè)AOPP對(duì)Caspase-3片斷蛋白表達(dá)變化的時(shí)間效應(yīng)。 取同步生長(zhǎng)的INS-1細(xì)胞分別與50、100、200、400μg/ml AOPP或400μg/ml未經(jīng)修飾的RSA共同孵育48小時(shí)，以單純培養(yǎng)基培

11、養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Western Blotting檢測(cè)AOPP對(duì)Caspase-3片斷蛋白表達(dá)變化的劑量效應(yīng)。 6.INS-1細(xì)胞氧化水平的檢測(cè)。 6.1 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的檢測(cè)： 取同步生長(zhǎng)的INS-1細(xì)胞，裝載熒光探針即加入0.1 μmol/l 2，7-二氫二氯熒光素（DCFH）標(biāo)記細(xì)胞，37℃孵育30分鐘，然后加入400μg/ml AOPP分別孵育5、15、30、60分鐘

12、，以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，檢測(cè)AOPP誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）生成的時(shí)間效應(yīng)。 取同步生長(zhǎng)的INS-1細(xì)胞，裝載熒光探針，而后加入50、100、200、400μg/mlAOPP或400μg/ml未經(jīng)修飾的RSA孵育30分鐘，以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，檢測(cè)AOPP誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）生成的劑量效應(yīng)。 收集完整細(xì)胞，用冷PBS洗3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS生成量。

13、 在阻斷實(shí)驗(yàn)中，INS-1細(xì)胞分別與各種可能產(chǎn)生活性氧的酶的抑制劑于37℃預(yù)孵育1小時(shí)，而后加入AOPP、RSA等刺激因素。所采用的抑制劑包括NADPH氧化酶抑制劑二苯碘鎓 100μmol/L、夾竹桃麻素10μmol/L、NO合酶抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯（10μmol/L、黃嘌呤氧化酶抑制劑oxypurinol 100μmol/L、胞漿型超氧化物歧化酶C-SOD 200 U/ml、環(huán)氧化酶抑制劑吲哚美辛10 μmol/L、線粒體

14、電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅰ抑制劑魚滕酮250μmol/L、復(fù)合體Ⅱ抑制劑TTFA 10μmol/L、復(fù)合體Ⅲ氧化中心抑制劑myxothiazol 10μmol/L等。然后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）生成量。 6.2 細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子（O2-）的檢測(cè)： 用能與H2O2、O2-等過氧化物特異性結(jié)合、反應(yīng)的光澤精試劑，在NADPH為底物的條件下，檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)AOPP、RSA刺激后細(xì)胞內(nèi)O2-的生成量，間接反映NADPH氧化酶的活

15、性。 取同步生長(zhǎng)的INS-1細(xì)胞，加入400μg/ml AOPP分別孵育5、15、30、60分鐘，以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，裂解細(xì)胞收集細(xì)胞勻漿。各組分別加100μg細(xì)胞蛋白至96孔測(cè)量板中，上機(jī)檢測(cè)前，各孔加入暗適應(yīng)的光澤精5μM及底物NADPH 100μM。VICTOR1420多標(biāo)記分析系統(tǒng)動(dòng)態(tài)檢測(cè)各組NADPH依賴的O2-產(chǎn)生的熒光量，間接反映O2-的產(chǎn)量及NADPH氧化酶活性。 取同步生長(zhǎng)的INS-1細(xì)

16、胞，分別加入50、100、200、400μg/ml AOPP或400μg/ml未經(jīng)修飾的RSA孵育30分鐘，以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，裂解細(xì)胞收集細(xì)胞勻漿。VICTOR1420多標(biāo)記分析系統(tǒng)動(dòng)態(tài)檢測(cè)各組NADPH依賴的O2-產(chǎn)生的熒光量。所測(cè)得的數(shù)據(jù)用“CPS”表示，即每秒通過光子數(shù)：counts per second。 7.NADPH氧化酶的活化-p47phox磷酸化的檢測(cè)。 取同步生長(zhǎng)的INS-1細(xì)胞，加入

17、400μg/ml AOPP分別孵育5、15、30、60分鐘，以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，收集細(xì)胞總蛋白。免疫沉淀及Western Blotting檢測(cè)p47phox磷酸化及總的p47phox蛋白含量。 8.統(tǒng)計(jì)方法。 所有數(shù)據(jù)均代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有統(tǒng)計(jì)由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0完成。多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA，兩兩比較采用LSD和SNK，P<0.05為有顯著差異。