NADPH氧化酶對(duì)apoE基因敲除小鼠腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化的影響.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種緩慢而復(fù)雜的進(jìn)行性病變過(guò)程。AS早期發(fā)病機(jī)制的研究對(duì)AS早期預(yù)防與治療具有十分重要的意義。
　　動(dòng)脈內(nèi)膜局部損傷后，血漿脂質(zhì)進(jìn)入動(dòng)脈內(nèi)膜，在內(nèi)膜下間隙沉積；低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)經(jīng)化學(xué)修飾成氧化型 LDL(oxidized LDL，ox-LDL)或被乙酰化成乙酰 LDL，修飾后的LDL經(jīng) CD36、SR-A等清道夫受體，無(wú)限制

2、地被巨噬細(xì)胞攝取而形成泡沫細(xì)胞。隨著巨噬細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)逐漸的增多和泡沫細(xì)胞不斷堆積，動(dòng)脈內(nèi)膜下局部細(xì)胞脂代謝及炎癥狀態(tài)發(fā)生改變，經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的細(xì)胞和分子間相互作用逐漸形成動(dòng)脈壁脂質(zhì)條紋，即 AS早期病變。
　　巨噬泡沫細(xì)胞的形成是AS早期病變的主要事件之一。NADPH氧化酶來(lái)源的活性氧(reactive oxygen species，ROS)在巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但 NADPH氧化酶在AS發(fā)生發(fā)展中的作用尚存在爭(zhēng)議

3、。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，p47phox-/-/apoE-/-小鼠相比于apoE-/-小鼠 AS病變顯著降低，而且，相比于野生型小鼠，p47phox-/-小鼠動(dòng)脈 O2-水平顯著降低。單核/巨噬細(xì)胞 NADPH氧化酶來(lái)源的超氧陰離子一定程度上促進(jìn)了AS的發(fā)展。另有報(bào)道顯示，gp91phox-/-/apoE-/-小鼠與 apoE-/-小鼠相比，AS病變無(wú)明顯差異，這表明 gp91phox基因缺失并不影響 AS病變發(fā)展。另有研究結(jié)果表明，p47p

4、hox-/-/apoE-/-小鼠與 apoE-/-小鼠相比，AS病變及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血壓無(wú)明顯差異，這表明，NADPH氧化酶功能的喪失并不影響 apoE-/-小鼠 AS病變發(fā)展。以上兩種研究結(jié)果截然相反，因此，NADPH氧化酶在AS發(fā)生發(fā)展中的具體作用還需要進(jìn)一步深入研究。
　　體外實(shí)驗(yàn)研究表明，ox-LDL可通過(guò)Toll受體4介導(dǎo)的信號(hào)通路激活巨噬細(xì)胞 Nox2從而產(chǎn)生 ROS，進(jìn)而促進(jìn) AS的發(fā)生與發(fā)展。體外條件下，巨噬細(xì)胞泡沫化

5、過(guò)程中產(chǎn)生的ROS可調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性；ROS可調(diào)節(jié)人單核細(xì)胞系 THP-1 I型清道夫受體的表達(dá)；氧化應(yīng)激可通過(guò)調(diào)節(jié) PPARs等核轉(zhuǎn)錄因子及ABCA1的表達(dá)影響人單核細(xì)胞系THP-1膽固醇外流。一系列研究說(shuō)明，氧化應(yīng)激可以通過(guò)調(diào)節(jié)重要核轉(zhuǎn)錄因子及膽固醇內(nèi)流和外流相關(guān)受體來(lái)影響巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程，并最終影響 AS的發(fā)生與發(fā)展。但 NADPH氧化酶來(lái)源的ROS在巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中的作用機(jī)制尚不十分明確。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)以

6、體外培養(yǎng)的apoE-/-和WT小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，利用NADPH氧化酶活性抑制劑二亞苯基碘(diphenyleneiodonium chloride，DPI)處理 ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬泡沫細(xì)胞，通過(guò)病理形態(tài)學(xué)、real-time RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)等研究手段在細(xì)胞水平和分子水平上檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中不同階段的各項(xiàng)指標(biāo)，旨在初步研究NADPH氧化酶對(duì)apoE-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程的影響，以期進(jìn)一步探討巨

7、噬泡沫細(xì)胞形成及AS發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:
　　1.細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)結(jié)果:apoE-/-和WT小鼠中，ox-LDL可在24 h內(nèi)誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞發(fā)生泡沫化，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)泡沫化程度逐漸加重。apoE-/-小鼠中，48 h內(nèi)，NADPH氧化酶的活化對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程無(wú)明顯影響。WT小鼠中，NADPH氧化酶的活化可明顯加速或促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化。
　　2.活性氧檢測(cè)結(jié)果:在apoE-/

8、-和WT小鼠中，NADPH氧化酶活性可明顯被 DPI抑制，且DPI可明顯減少 ox-LDL誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞超氧陰離子(O2-)和總 ROS的產(chǎn)生(p<0.05).48h內(nèi)，兩種基因型相比，O2-和總 ROS的變化無(wú)明顯差異(p>0.05)。
　　3. NADPH氧化酶對(duì)apoE-/-和WT小鼠腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　在WT小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，與 ox-LDL處理組相比，6 h時(shí)，DPI可顯著下調(diào) Nox

9、2、PPARα、LXRα、CD36和SR-A的mRNA水平(p<0.05)，顯著上調(diào) PPARγ、NF-κB和SR-BI的mRNA水平(p<0.05)，ABCA1、p47phox mRNA水平無(wú)顯著變化(p>0.05)；24 h時(shí)，ox-LDL+DPI處理組與 ox-LDL處理組相比，p47phox、PPARα、PPARγ、LXRα、NF-κB、CD36、SR-A、ABCA1和SR-BI mRNA水平均被顯著上調(diào)(p<0.05)，Nox

10、2 mRNA水平無(wú)顯著變化(p>0.05)。
　　在apoE-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，與 ox-LDL處理組相比，6 h時(shí)，DPI可顯著上調(diào)Nox2、p47phox、PPARα、PPARγ、LXRα、NF-κB、CD36、SR-A、ABCA1和SR-BI的mRNA水平(p<0.05)。24 h時(shí)，ox-LDL+DPI處理組與 ox-LDL處理組相比，PPARα、ABCA1和SR-BI的mRNA水平被顯著上調(diào)(p<0.05)，Nox

11、2、PPARγ的mRNA水平被顯著下調(diào)，p47phox、LXRα、NF-κB、CD36和SR-A的mRNA水平無(wú)顯著差異(p>0.05)。
　　在apoE-/-和WT小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，24 h時(shí)，ox-LDL可通過(guò)ROS激活 NF-κB，且DPI可顯著抑制 NF-κB的活性(p<0.05)。24 h時(shí)，ABCA1和PPARγ蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(p>0.05)。
　　綜上所述，NADPH氧化酶可在一定程度上加速或促進(jìn)小鼠腹腔