湘云鯽干擾素a及干擾素a2的功能機(jī)制研究.pdf

1、高等脊椎動(dòng)物依靠免疫系統(tǒng)來抵抗病原微生物的侵襲，其免疫系統(tǒng)分為天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)。天然免疫又稱為先天免疫或固有免疫，能夠?yàn)樗拗魈峁┭杆俚翘禺愋缘拿庖弑Ｗo(hù);天然免疫系統(tǒng)存在于所有動(dòng)植物中。魚類同時(shí)具有這兩種免疫系統(tǒng)，但其更依賴天然免疫抵抗病原微生物的入侵。干擾素(IFN)是一類小分子的細(xì)胞因子，在高等脊椎動(dòng)物中的天然免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮關(guān)鍵作用;在魚類中，干擾素對(duì)宿主抵抗病毒也是至關(guān)重要的。
　　三倍體湘云鯽的抗病能

2、力遠(yuǎn)強(qiáng)于其親本二倍體紅鯽和異源四倍體鯽鯉。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)三倍體湘云鯽的天然免疫系統(tǒng)展開了廣泛研究，力求闡明湘云鯽抗病力強(qiáng)的機(jī)制。我們的前期工作已經(jīng)克隆了兩種湘云鯽Ⅰ型干擾素(即3nIFNa和3nIFNa2)，構(gòu)建了其重組表達(dá)質(zhì)粒并在真核細(xì)胞中成功表達(dá)了3nIFNa及3nIFNa2，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明3nIFNa是分泌出胞的細(xì)胞因子，而3nIFNa2為一種胞內(nèi)細(xì)胞因子。
　　在本文中，我們對(duì)3nIFNa和3nIFNa2在宿主抗病毒天然免疫

3、反應(yīng)中的功能機(jī)制進(jìn)行了探究，具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.分別用鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、草魚呼腸孤病毒(GCRV)和PBS緩沖液注射湘云鯽，采用實(shí)時(shí)定量PCR(q-PCR)檢測(cè)3nIFNa和3nIFNa2在上述湘云鯽心臟、表皮、脾臟、腎臟、腸、肝臟、鰓等組織中的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示SVCV和GCRV感染組中3nIFNa和3nIFNa2的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組;該結(jié)果說明3nIFNa和3nIFNa2均參與了宿主抗病毒

4、天然免疫反應(yīng)。
　　2.制備和收集含3nIFNa的細(xì)胞上清液對(duì)EPC細(xì)胞進(jìn)行預(yù)孵育，之后采用SVCV和GCRV分別感染上述EPC細(xì)胞。結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)和噬斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect/CPE)遠(yuǎn)低于對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的病毒滴度顯著低于對(duì)照組細(xì)胞中的病毒滴度。
　　3.分別在EPC細(xì)胞中表達(dá)3nIFNa和3nIFNa2;之后分別采用SVCV及GCRV分別感染上述EPC細(xì)胞。結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)和噬斑

5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞CPE遠(yuǎn)低于對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的病毒滴度顯著低于對(duì)照組細(xì)胞中的病毒滴度。
　　4.糖苷酶消化實(shí)驗(yàn)表明3nIFNa2具有N-連接糖基化修飾;其糖基化位點(diǎn)為177氨基酸位點(diǎn)的天冬酰胺。構(gòu)建了其非糖基化突變體3 nIFNa2-N177Q，蛋白印跡雜交實(shí)驗(yàn)表明3nIFNa2-N177Q也為非分泌蛋白。結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)和噬斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3 nIFNa2-N177Q具有野生型3nIFNa2類似的抗SCVC及GCRV的能力。