豬干擾素-γ基因的克隆及其表達.pdf

1、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文豬干擾素γ基因的克隆及其表達姓名：陳幸德申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：楊國慶陳永福20030701中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要豬干擾素一Y基因的克隆及其表達中文摘要從豬的肝臟組織中提取基因組DNA，用長鏈PCR的方法擴增得到豬的干擾素一Y基因，經(jīng)測序表明其與GenBank中發(fā)表的豬干擾素一Y基因序列的同源性為99％左右。將其純化后克隆到真核表達載體PCI—neo載體中組裝成了真核表達載

2、體PCI—neo—PolFNY。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組載體PCI—rleo—PoIFNY轉(zhuǎn)染入倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中，在G418的存在下進行篩選培養(yǎng)。獲得了能表達豬干擾素一Y的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用UNIQ10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取總RNA。并通過RTPCR的方法擴增獲得豬干擾素一YcDNA基因，這也從另一途徑證實了豬干擾素一Y基因已成功地整合到細(xì)胞染色體中并能正確的轉(zhuǎn)錄出其mRNA。將獲得的豬干擾素一ycDNA

3、基因克隆入原核表達載體pBV220中，組裝成了原核表達載體pBV220cPolFNY，經(jīng)正反測序表明其與GenBank中發(fā)表的豬干擾素一YeDNA序列完全相同將這個表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達菌株D晦口和BL21中。溫度誘導(dǎo)培養(yǎng)后，經(jīng)SDS—PAGE和Western實驗檢測可知特異表達帶約在17KD的位置，井證實在菌株DH5Ⅱ和BL21中的表達量沒有明顯的差異。其表達量都約占細(xì)菌總蛋白的15％左右。關(guān)鍵詞：豬干擾素一Y，真核表達載體，轉(zhuǎn)染