干擾素β調(diào)節(jié)分子機(jī)制研究.pdf

1、乙型、丙型病毒性肝炎嚴(yán)重危害我國人民健康。但是到目前為止還沒有有效而可靠的抗病毒根治辦法。雖然干擾素α(IFNα)有一定的抗病毒作用，但研究表明僅對(duì)30％～40％的病人有效。拉米夫定、阿德福韋酯等雖然有一定抗病毒效果，但長(zhǎng)期使用易引起病毒耐藥變異，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，對(duì)IFNα或拉米夫定等治療無效的患者仍需探索新的治療途徑。 近年來研究表明，干擾素β(IFNβ)與干擾素α一樣，是一種具有多種生物學(xué)作用的重要細(xì)胞因子，雖然其與

2、IFNα抗病毒作用機(jī)理相似，但I(xiàn)FNβ具有獨(dú)特性，而這一獨(dú)特性與IFNβ的抗病毒效果緊密相關(guān)。因而IFNβ在乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌的治療中具有重要應(yīng)用前景。近年來的臨床資料表明，由于IFNβ不易產(chǎn)生抗體，可有效治療干擾素α治療無效的慢性乙型肝炎、丙型肝炎患者，而且在治療慢性丙型肝炎導(dǎo)致的肝細(xì)胞癌方面IFNβ比IFNα有更好的抗腫瘤治療效果。但是到目前為止，IFNβ對(duì)于機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和抗病毒、抗肝纖維化、抗肝細(xì)胞癌治療的分子

3、機(jī)制還不十分清楚。 本研究利用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，研究肝細(xì)胞內(nèi)影響IFNβ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的因素、IFNβ對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)譜的影響以及與IFNβ具有相互作用的肝細(xì)胞結(jié)合蛋白。以期能從中發(fā)現(xiàn)某些有價(jià)值的線索，為闡明IFNβ獨(dú)特的抗病毒功能提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 為探索IFNβ對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)譜的影響，我們首先以分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-IFNβ，以空載體pcDNA3.1(-)為平行對(duì)照，轉(zhuǎn)染Hep

4、G2細(xì)胞，并制備細(xì)胞裂解液。應(yīng)用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)，構(gòu)建差異表達(dá)的cDNA消減文庫，對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序和同源性分析，初步確定IFNβ真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后上調(diào)或下調(diào)的基因；同時(shí)應(yīng)用不同濃度的重組IFNβ刺激對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以生理鹽水處理的HepG2細(xì)胞為平行對(duì)照，制備細(xì)胞裂解液。提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行SSH的2次雜交PCR擴(kuò)增，篩選重組IFNβ作用肝細(xì)胞后差異表達(dá)的基因。抑制性消減雜交結(jié)果

5、表明，共獲得了25種上調(diào)表達(dá)的基因，其中包括兩種未知功能基因；23種下調(diào)表達(dá)的基因，其中包括一種未知功能的基因。 應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)，篩選真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-IFNβ轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后差異表達(dá)的基因及重組IFNβ刺激HepG2細(xì)胞后上調(diào)或下調(diào)的基因。結(jié)果顯示，IFNβ能夠上調(diào)和下調(diào)肝細(xì)胞中多種基因的表達(dá)。包括與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白翻譯合成、腫瘤發(fā)生及物質(zhì)代謝密切相關(guān)的蛋白編碼基因。 I

6、FNβ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受多種因素的影響。為探討肝細(xì)胞內(nèi)對(duì)IFNβ轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用的因素，我們應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)，以IFNβ啟動(dòng)子DNA片段做為固相篩選分子，對(duì)噬菌體人肝細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行5輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增，，富集過程。對(duì)第五輪噬斑裂解物PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行DNA序列分析和同源性生物信息學(xué)搜索。結(jié)果篩選出15個(gè)陽性克隆，并分析了這些蛋白的功能，推測(cè)其在體內(nèi)可能存在功能的線索。 肝炎病毒具有嗜肝性。IFNβ主要在肝細(xì)胞中發(fā)揮其抗肝

7、炎病毒作用。由于肝細(xì)胞本身可以合成、分泌多種蛋白，因而推測(cè)IFNβ必然會(huì)與肝細(xì)胞內(nèi)某些蛋白具有相互作用。為篩選人肝細(xì)胞cDNA文庫中與IFNβ具有結(jié)合作用的蛋白，我們構(gòu)建了IFNβ的酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-IFNβ，并轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH109，以SDS-PAGE和Westernblot分析蛋白表達(dá)情況。以IFNβ為誘餌蛋白，應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)，在肝細(xì)胞文庫中釣取IFNβ的肝細(xì)胞結(jié)合蛋白。酵母雙雜交結(jié)果顯示，IFNβ可與肝細(xì)胞內(nèi)15種蛋白