USP18對(duì)干擾素α和干擾素λ抗病毒信號(hào)通路的影響及意義.pdf

1、目的:干擾素（interferon，IFN）是目前慢性乙型病毒性肝炎(ChronicHepatitis B，CHB)和慢性丙型病毒性肝炎(Chronic Hepatitis C，CHC)抗病毒治療過(guò)程中一個(gè)重要的組成部分。在抗乙型肝炎病毒藥物中，IFN與核苷（酸）類(lèi)似物相比具有療程短、停換藥方便等優(yōu)勢(shì);在慢性丙型病毒肝炎治療中，IFN聯(lián)合利巴韋林還是其標(biāo)準(zhǔn)治療方案。雖然目前已有數(shù)十種干擾素被發(fā)現(xiàn)，然而在中國(guó)僅有隸屬于Ⅰ型干擾素的IFN-

2、α應(yīng)用到病毒性肝炎的抗病毒治療中。但是，在此治療過(guò)程中僅有30％-40％ CHB患者能達(dá)到e抗原的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，約有60％的患者對(duì)其治療應(yīng)答不佳;而且有50％-60％的基因1型CHC患者無(wú)法得到持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SustainedVirological Response，SVR)。與此同時(shí)，由于IFN-α的諸多副作用，部分患者在治療過(guò)程中還因?yàn)閲?yán)重的副反應(yīng)而終止治療。近期研究發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶18(Ubiquitin-specific p

3、rotease18，USP18)是IFN-α療效的重要影響因子，并且進(jìn)一步研究證實(shí)USP18是IFN-α治療效果的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子。IFN-λ是最新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)新型干擾素，隸屬于Ⅲ型干擾素;與IFN-α類(lèi)似它也是通過(guò)激活JAK-STAT（Janus activated kinase-signal transducerand activator of transcription，JAK-STAT）通路并調(diào)控一系列抗病毒蛋白如:雙鏈RNA依賴(lài)

4、的蛋白激酶R(PKR)和抗黏病毒蛋白(mixovirus resistanceprotein A，MxA)來(lái)發(fā)揮抗病毒作用。最新體外研究發(fā)現(xiàn)在IFN-α應(yīng)答不佳的細(xì)胞中IFN-λ仍然可以發(fā)揮抗病毒作用。關(guān)于USP18在IFN-α的抗病毒通路中的研究進(jìn)展很多，但對(duì)于其在IFN-λ的抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的影響報(bào)道甚少。本研究旨在探討USP18對(duì)IFN-α和IFN-λ抗病毒信號(hào)通路的不同影響及其臨床意義。
　　方法:復(fù)蘇Huh-7細(xì)胞用

5、含10％胎牛血清、1％青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基在5％ CO2，37℃條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后分為空白對(duì)照組、IFN-α實(shí)驗(yàn)組和IFN-λ實(shí)驗(yàn)組。
　　1 IFN-α實(shí)驗(yàn)組給予IFN-α2a(20IU/ml)，IFN-λ實(shí)驗(yàn)組給予IFN-λ1(10ng/ml)進(jìn)行刺激，空白對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)并加入等體積無(wú)菌生理鹽水，分別于6h，12h，24h，48h后收細(xì)胞。
　　2空白對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)并加入無(wú)菌生理鹽水，IFN-α實(shí)驗(yàn)組給

6、予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ實(shí)驗(yàn)組給予IFN-λ1(10ng/ml)進(jìn)行刺激12小時(shí)，然后三組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗三遍后重新置入新鮮的無(wú)干擾素培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，然后分別再次給予無(wú)菌生理鹽水、IFN-α2a（20IU/ml）和IFN-λ1（10ng/ml）刺激12h后收細(xì)胞。
　　3空白對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)并加入無(wú)菌生理鹽水，IFN-α實(shí)驗(yàn)組給予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ實(shí)驗(yàn)組給予IFN-λ1

7、（10ng/ml）進(jìn)行刺激12小時(shí)，然后三組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗三遍后重新置入新鮮的無(wú)干擾素培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，然后再分別給予無(wú)菌生理鹽水、IFN-λ1（10ng/ml）和IFN-α2a（20IU/ml）刺激12h后收細(xì)胞。
　　實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連反應(yīng)(Real Time-quantitative Polymerase ChainReaction，RT-qPCR)法檢測(cè)Huh-7細(xì)胞USP18、STAT1、PKR和MxA

8、的mRNA表達(dá)水平。Western-blot檢測(cè)USP18、P-STAT1、STAT1、PKR及MxA的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1不同干擾素刺激時(shí)間(6h，12h，24h，48h)各組Huh-7細(xì)胞指標(biāo)的變化:
　　1.1各組細(xì)胞USP18的表達(dá)變化:
　　隨著干擾素刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，IFN-α實(shí)驗(yàn)組和IFN-λ實(shí)驗(yàn)組Huh-7細(xì)胞內(nèi)USP18 mRNA的表達(dá)增加，但I(xiàn)FN-α組比IFN-λ組增加更為明顯且

9、在24h、48h USP18 mRNA的表達(dá)明顯高于IFN-λ組(5.33±0.47 VS4.60±0.42，5.41±0.46 VS4.76±0.78)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。此外，IFN-α組和IFN-λ組細(xì)胞的USP18 mRNA均高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。隨著干擾素刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，IFN-α組和IFN-λ組Huh-7細(xì)胞內(nèi)USP18蛋白的表達(dá)也開(kāi)始增加，IFN-α組比IFN-λ組增加更明顯且在

10、48h時(shí)USP18蛋白的升高明顯大于IFN-λ組（1.61±0.04 VS1.46±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　1.2不同刺激時(shí)間各組細(xì)胞STAT1、PKR和MxA的表達(dá)變化以及STAT1磷酸化蛋白的變化:
　　1.2.1隨著干擾素刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，IFN-α組和IFN-λ組Huh-7細(xì)胞內(nèi)STAT1、PKR和MxA mRNA表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且在刺激12h時(shí)IFN-α組STAT1、PKR和MxA m

11、RNA表達(dá)水平達(dá)到最高，且明顯高于IFN-λ組(5.61±0.44 VS4.84±0.33,5.42±0.37 VS4.68±0.15,3.82±0.35 VS3.23±0.46)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）。隨后，IFN-α組的STAT1、PKR和MxA mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，而IFN-λ組的表達(dá)繼續(xù)上升并在24h時(shí)達(dá)到高峰，并且高于IFN-α組(5.30±0.15 VS5.95±0.37，4.81±0.43VS5.

12、81±0.40，3.37±0.46 VS4.63±0.62)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）。此后兩組的STAT1、PKR和MxA mRNA表達(dá)開(kāi)始下降，但48h IFN-λ組仍高于IFN-α組。各組Huh-7細(xì)胞STAT1、PKR和MxA蛋白水平變化與mRNA表達(dá)變化類(lèi)似。
　　1.2.2隨著干擾素刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，IFN-α組和IFN-λ組Huh-7細(xì)胞內(nèi)STAT1磷酸化蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。IFN-α組的STAT1磷酸

13、化蛋白表達(dá)水平高于IFN-λ組，并且在刺激12h時(shí)IFN-α組STAT1磷酸化蛋白表達(dá)水平達(dá)到最高，且明顯高于IFN-λ組（1.19±0.02 VS0.63±0.02），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨后，IFN-α組STAT1磷酸化蛋白表達(dá)開(kāi)始下降，IFN-λ組的表達(dá)繼續(xù)上升并在24h時(shí)達(dá)到高峰，并且高于IFN-α組(0.71±0.01 VS1.25±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2三組細(xì)胞分別給予無(wú)菌

14、生理鹽水、IFN-α2a（20IU/ml）、IFN-λ1(10ng/ml)進(jìn)行刺激12h后更換無(wú)干擾素的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)16h后再次給予無(wú)菌生理鹽水、IFN-α2a(20IU/ml)、IFN-λ1（10ng/ml）刺激12h后細(xì)胞各個(gè)指標(biāo)的變化。
　　2.1各指標(biāo)mRNA表達(dá)的變化:
　　IFN-α組的USP18 mRNA表達(dá)高于IFN-λ組(4.04±0.39 VS3.25±0.26)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IF

15、N-α組STAT1、PKR、MxA的mRNA表達(dá)均低于IFN-λ組(4.71±0.28 VS6.54±0.26，3.71±0.25 VS5.41±0.32，2.91±0.23VS4.31±0.19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。
　　2.2各指標(biāo)蛋白表達(dá)水平的變化:
　　IFN-α組的USP18蛋白表達(dá)高于IFN-λ且(1.93±0.15 VS1.82±0.14)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IFN-α組ST

16、AT1、P-STAT1、PKR、MxA的蛋白表達(dá)均低于IFN-λ組分別為(1.13±0.16 VS1.61±0.17，1.12±0.18 VS1.49±0.15，1.31±0.13 VS1.91±0.16，1.09±0.19 VS1.59±0.10)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。
　　3三組細(xì)胞分別給予無(wú)菌生理鹽水、IFN-α2a（20IU/ml）、IFN-λ1（10ng/ml）進(jìn)行刺激12h后更換無(wú)干擾素的新鮮培養(yǎng)基培

17、養(yǎng)16h后再給予無(wú)菌生理鹽水、IFN-λ1(10ng/ml)、IFN-α2a（20IU/ml）刺激12h后細(xì)胞各個(gè)指標(biāo)的變化。
　　3.1各指標(biāo)mRNA表達(dá)的變化:
　　IFN-α組的USP18 mRNA表達(dá)與IFN-λ組（3.54±0.28 VS3.46±0.31）相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。IFN-α組STAT1、PKR和MxA的mRNA表達(dá)低于IFN-λ組（5.69±0.22 VS5.81±0.33，4.31

18、±0.20 VS4.76±0.26，3.49±0.27VS3.80±0.20），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。
　　3.2各指標(biāo)蛋白表達(dá)水平的變化:
　　IFN-α組USP18蛋白表達(dá)低于IFN-λ組（1.76±0.16 VS1.90±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩組細(xì)胞P-STAT1表達(dá)無(wú)差異（1.29±0.15 VS1.30±0.19，P＞0.05）。IFN-α組PKR、MxA蛋白表達(dá)低于IFN

19、-λ組(1.40±0.10VS1.49±0.14，1.23±0.11 VS1.42±0.14)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1在Huh-7細(xì)胞內(nèi)IFN-λ的抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不受USP18的影響。
　　2在對(duì)IFN-α刺激不敏感的Hun-7細(xì)胞中IFN-λ仍能激活抗病毒信號(hào)通路，促進(jìn)抗病毒蛋白的生成。
　　3 IFN-α刺激Huh-7細(xì)胞后抗病毒蛋白生成迅速，但消退速度也快;而IFN-λ刺