隔山香中苯丙素類(lèi)成分及異蒔蘿腦乙二醇舒張血管平滑肌活性研究.pdf

1、目的:
　　隔山香是我國(guó)特有植物物種，有疏風(fēng)清熱，祛痰止咳，活血散瘀，行氣止痛的功效，臨床上常用于咳嗽，胸痹心痛，風(fēng)濕痹痛，胃脘脹痛，跌打損傷等。隔山香的臨床應(yīng)用及文獻(xiàn)研究顯示其具有舒張心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖泌尿系統(tǒng)平滑肌的作用，特別對(duì)主動(dòng)脈平滑肌舒張作用顯著。目前，隔山香藥材的基礎(chǔ)研究薄弱，相關(guān)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制尚不清楚。課題組前期研究顯示隔山香乙酸乙酯部位有較好的舒張離體大鼠血管平滑肌的活性，本研究在課題組

2、前期工作的基礎(chǔ)上，以“譜效結(jié)合”的思路對(duì)隔山香乙酸乙酯部位進(jìn)行化學(xué)成分分離得到活性單體，并對(duì)隔山香藥材的質(zhì)量控制進(jìn)行了研究;對(duì)分離得到的活性成分在離體器官水平上開(kāi)展其舒張大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌的作用機(jī)制研究，并在細(xì)胞水平上探討活性成分對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的作用機(jī)制。本研究繼承課題組前期研究基礎(chǔ)，更進(jìn)一步豐富了隔山香的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，闡釋隔山香藥材“行氣止痛”的科學(xué)內(nèi)涵，為隔山香的基礎(chǔ)研究提供參考。
　　方法:
　　1.隔山香乙酸乙

3、酯部位的化學(xué)成分研究。以離體大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)模型為指導(dǎo)，采用“譜效結(jié)合”的方法對(duì)隔山香乙酸乙酯部位進(jìn)行活性成分的分離，并對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。對(duì)有較好藥理活性的化合物，使用TLC和HPLC對(duì)隔山香藥材進(jìn)行質(zhì)量控制研究。
　　2.隔山香活性單體成分對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)張力的影響。以離體大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)為模型，考察活性成分異蒔蘿腦乙二醇(Isodillapiolglycol，Iso)(200、400、800μg/ml)對(duì)去甲腎

4、上腺素(NE)及氯化鉀(KCl)預(yù)收縮的離體大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)（包括內(nèi)皮完整及去除內(nèi)皮血管環(huán)）張力的影響;在無(wú)鈣的Kreb's液中，考察Iso（800μg/ml）對(duì)CaCl2收縮血管環(huán)的量效曲線的影響;維拉帕米預(yù)孵血管后以NE預(yù)收縮血管環(huán)，考察Iso(200、400、800μg/ml)對(duì)去除內(nèi)皮的血管環(huán)張力的影響;鉀離子通道阻斷劑氯化四乙胺(TEA)與BaCl2分別預(yù)孵血管后以NE收縮血管環(huán)，考察Iso（200、400、800μg/ml

5、）對(duì)去除內(nèi)皮的血管環(huán)張力的影響。
　　3.隔山香活性成分Iso對(duì)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)實(shí)時(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，對(duì)于含外鈣組細(xì)胞考察Iso（200、400、800μg/mL）對(duì)KCl所致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化的影響;對(duì)不含外鈣組細(xì)胞分別考察Iso(200、400、800μg/mL)對(duì)NE及CaCl2所致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化的影響。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)對(duì)隔山香乙酸

6、乙酯部位化學(xué)成分純化分離，共得到5個(gè)化合物，分別為異蒔蘿腦乙二醇、1'，2'-蘇式-1'，2'-二羥基-2，3-二甲氧基-4，5-亞甲二氧基丙基苯、紫花前胡內(nèi)酯、(+)-落葉松脂醇、Ostercitriodin A，其中1'，2'-蘇式-1'，2'-二羥基-2，3-二甲氧基-4，5-亞甲二氧基丙基苯與Ostercitriodin A為新化合物。以活性較好的化學(xué)成分異蒔蘿腦乙二醇為對(duì)照，為其建立了TLC鑒別及HPLC含量測(cè)定，隔山香藥材在

7、優(yōu)化的色譜條件下的薄層斑點(diǎn)清晰，分離效果好;異蒔蘿腦乙二醇液相色譜峰分離良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.0468～0.4684μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999）;精密度、重復(fù)性以及穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD值分別為0.99％、0.91％、1.11％，樣品平均回收率為101.43％，RSD=1.41％，均符合要求。
　　2.不同劑量的Iso均對(duì)NE及KCl預(yù)收縮的內(nèi)皮完整的血管環(huán)及去除內(nèi)皮的血管環(huán)有顯著的舒張作用，并呈濃度依賴性。Iso濃度為2

8、00、400、800μg/ml時(shí)，內(nèi)皮完整的血管環(huán)及去除內(nèi)皮的血管環(huán)的舒張率對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.在無(wú)鈣Kreb's液中，經(jīng)過(guò)Iso（終濃度800μg/ml）孵育后的去除內(nèi)皮的血管環(huán)在不同濃度的Ca2+條件下，其相對(duì)收縮率均顯著低于對(duì)照組，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.維拉帕米預(yù)孵后以NE收縮血管環(huán)，中、高劑量的Iso對(duì)維拉帕米預(yù)孵的無(wú)內(nèi)皮血管環(huán)舒張作用均顯著降低，且呈濃度依賴性。TEA預(yù)孵去除內(nèi)皮的血管環(huán)并以NE收縮

9、血管后，中、高劑量的Iso均對(duì)血管環(huán)的舒張作用顯著降低，BaCl2預(yù)孵去除內(nèi)皮的血管環(huán)并以NE收縮血管后，與各劑量對(duì)照組相比，給藥組沒(méi)有顯著性差別。
　　5.激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在有鈣條件下，KCl刺激血管平滑肌細(xì)胞后，低、中、高劑量組Iso最大平均熒光強(qiáng)度值均低于對(duì)照組，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度均出現(xiàn)不同程度的抑制效應(yīng)，其抑制率分別為14.84％、34.82％、52.58％，有一定的濃度依賴性;在無(wú)鈣條件下，NE刺激并加入

10、CaCl2后各組的熒光強(qiáng)度均明顯增大，低、中、高劑量組的最大平均熒光強(qiáng)度值均顯著低于對(duì)照組。低、中、高劑量組對(duì)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的抑制率分別為11.93％、24.23％、65.95％，有一定的濃度依賴性。
　　結(jié)論:
　　1.本研究從隔山香藥材中分離出的化合物多屬于苯丙素類(lèi)成分;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所建立異蒔蘿腦乙二醇的定量定性方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。
　　2.對(duì)于去除內(nèi)皮以及內(nèi)皮完整的血管環(huán)，在NE、

11、KCl刺激后，Iso在不同濃度下對(duì)血管環(huán)的舒張作用沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Iso對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用是非內(nèi)皮依賴性的，可能與內(nèi)源性的血管舒張因子如一氧化氮、前列環(huán)素等無(wú)關(guān)，Iso是直接作用于血管平滑肌而引起的血管環(huán)舒張。Iso對(duì)NE、KCl刺激的去除內(nèi)皮的血管環(huán)均有顯著的舒張作用，表明Iso能通過(guò)抑制受體操縱性鈣通道(ROCC)與電壓依賴性鈣通道(VDCC)阻止細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，使平滑肌細(xì)胞舒張。
　　3.在無(wú)鈣

12、Kreb's液中，隨著外Ca2+濃度升高，對(duì)照組中去除內(nèi)皮的血管環(huán)張力隨之增大，這證實(shí)了KCl介導(dǎo)的外Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高引起細(xì)胞收縮;而經(jīng)過(guò)Iso（終濃度800μg/ml）孵育后的給藥組在不同濃度的Ca2+條件下，其相對(duì)收縮率均顯著低于對(duì)照組，表明Iso可通過(guò)抑制VDCC，阻止細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流降低血管的收縮率。
　　4.維拉帕米預(yù)孵血管后以NE收縮血管環(huán)，中、高劑量的Iso對(duì)維拉帕米預(yù)孵的去除內(nèi)皮的血

13、管環(huán)舒張作用均顯著降低，表明L-型鈣通道參與了Iso舒張血管的作用。TEA及BaCl2分別預(yù)孵去除內(nèi)皮的血管環(huán)以NE收縮血管后，中、高劑量的Iso均對(duì)TEA預(yù)孵的血管環(huán)舒張作用顯著降低，而低、中、高劑量的Iso均對(duì)BaCl2預(yù)孵后的血管環(huán)舒張率無(wú)影響，證明Iso的舒張血管作用與細(xì)胞膜上的鈣激活型鉀離子通道(KCa)有關(guān)，而與內(nèi)向整流型鉀離子通道(Kir)無(wú)關(guān)。
　　5.Iso能作用于VDCC，抑制高濃度KCl所引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃