穿心蓮內(nèi)酯改善MPTP帕金森小鼠運(yùn)動(dòng)功能及體外對(duì)抗魚藤酮損傷的線粒體機(jī)制.pdf

1、目的：
　　研究穿心蓮內(nèi)酯對(duì)抗MPTP誘導(dǎo)的小鼠帕金森病運(yùn)動(dòng)障礙和魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作用，探討穿心蓮內(nèi)酯對(duì)帕金森病患者的線粒體功能的影響，揭示其保護(hù)神經(jīng)元、防治帕金森病的可能機(jī)制，為穿心蓮內(nèi)酯的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　連續(xù)5天腹腔注射25 mg/kg MPTP誘導(dǎo)小鼠帕金森病，造模同時(shí)腹腔注射2.5 mg/kg和5 mg/kg穿心蓮內(nèi)酯給藥，連續(xù)12天，采用開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，爬桿實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)

2、，強(qiáng)迫游泳，懸掛實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠運(yùn)動(dòng)功能。采用Western Blot和免疫組化分析黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶的表達(dá)；Nissl染色來(lái)檢測(cè)小鼠中腦蛋白合成功能；MDA，SOD和Catalase試劑盒檢測(cè)小鼠黑質(zhì)部氧化應(yīng)激水平；TUNEL染色檢測(cè)小鼠黑質(zhì)部神經(jīng)元凋亡情況;采用ELISA檢測(cè)各組小鼠外周血炎癥因子水平，Real time-PCR檢測(cè)小鼠中腦區(qū)炎癥因子mRNA表達(dá)水平；免疫熒光染色檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志Iba-1；通過(guò)電鏡觀察分析小鼠黑質(zhì)

3、區(qū)線粒體數(shù)目和形態(tài)以及Real time-PCR檢測(cè)小鼠黑質(zhì)線粒體拷貝數(shù)和線粒體復(fù)制能力。離體實(shí)驗(yàn)中以不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯處理SH-SY5Y細(xì)胞3 h，加入30μmol/L Rotenone作用6h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活性；Annexin-V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。DCFH-DA染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）生成，JC-1染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的變化，熒光素酶法檢測(cè)ATP含量，Clark氧電極檢測(cè)細(xì)胞線粒體呼吸功能。MDA和SOD試

4、劑盒檢測(cè)細(xì)胞MDA，SOD含量分析細(xì)胞氧化應(yīng)激。MitoTracker green染色流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)線粒體數(shù)目變化，Real time-PCR分析線粒體拷貝數(shù)變化，電鏡觀察分析細(xì)胞中線粒體數(shù)目和形態(tài)。
　　結(jié)果：
　　在小鼠帕金森病模型中，我們發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯能夠改善PD樣小鼠的運(yùn)動(dòng)功能，表現(xiàn)為，穿心蓮內(nèi)酯給藥能夠提高PD樣小鼠在開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)距離和在中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間，縮短爬桿時(shí)間，延長(zhǎng)轉(zhuǎn)輪平衡時(shí)間，提高強(qiáng)迫游泳中PD樣

5、小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力以及懸掛實(shí)驗(yàn)中的抓握能力，同時(shí)能夠改善黑質(zhì)部分TH的表達(dá)和中腦蛋白合成功能。穿心蓮內(nèi)酯給藥能夠抑制PD樣小鼠黑質(zhì)部分的氧化應(yīng)激水平，表現(xiàn)為MDA含量的降低，SOD和Catalase水平的提高，減少大腦黑質(zhì)中神經(jīng)元的凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，維持黑質(zhì)部分神經(jīng)元線粒體的形態(tài)和功能。體外實(shí)驗(yàn)表明穿心蓮內(nèi)酯能夠有效的保護(hù)魚藤酮介導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。通過(guò)MTT檢測(cè)，倒置相差顯微鏡觀察以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡，穿心蓮內(nèi)酯劑量依賴性的

6、保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞。穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制魚藤酮誘導(dǎo)的ROS，恢復(fù)線粒體膜電位，增加細(xì)胞ATP，促進(jìn)細(xì)胞呼吸功能的改善，從而緩解魚藤酮引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激。穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制魚藤酮引起的線粒體DNA拷貝數(shù)降低，促進(jìn)線粒體DNA復(fù)制因子mRNA的表達(dá)，維持線粒體的正常形態(tài)。
　　結(jié)論：
　　以上結(jié)果說(shuō)明，穿心蓮內(nèi)酯具有顯著改善MPTP致PD樣小鼠云運(yùn)動(dòng)功能喪失的作用，抑制氧化應(yīng)激，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)線粒體DNA拷貝數(shù)，維持線粒體