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1、細(xì)胞凋亡是機(jī)體在生長(zhǎng)發(fā)育,維持機(jī)體良性運(yùn)轉(zhuǎn)以及應(yīng)對(duì)外界刺激時(shí)一種非常重要的主動(dòng)的的細(xì)胞程序性死亡。它的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致很多疾病的發(fā)生,比如阿爾茲海默癥、癌癥、艾滋病以及心臟病等。在凋亡過(guò)程中有許多蛋白家族參與其中,比如caspaSe家族和BCL2家族。Bcl2家族蛋白可以通過(guò)促進(jìn)或抑制線粒體膜的通透性調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。本篇研究中,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的泛素E3連接酶TRIM11能夠結(jié)合并降解Bcl2家族蛋白中的抗凋亡蛋白MCL1,從
2、而導(dǎo)致線粒體膜電位下降和細(xì)胞凋亡。本論文的主要工作如下:
1.通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM11對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響,發(fā)現(xiàn)TRIM11會(huì)明顯抑制HeLa細(xì)胞和HEK293T(293T)細(xì)胞的增殖能力。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TRIM11在血清饑餓條件下能更加明顯地抑制細(xì)胞增殖。使用碘化丙啶染色,流式檢測(cè)TRIM11對(duì)細(xì)胞周期的影響,發(fā)現(xiàn)TRIM11對(duì)293T細(xì)胞的細(xì)胞周期并沒(méi)有明顯影響。使用AnnexinⅤ/PI雙染,流式檢測(cè)TRIM11對(duì)細(xì)胞凋
3、亡的影響,發(fā)現(xiàn)TRIM11明顯促進(jìn)細(xì)胞早期凋亡,在血清饑餓條件下,細(xì)胞晚期凋亡比例上升。
2.通過(guò)細(xì)胞細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)和免疫熒光檢測(cè)TRIM11在細(xì)胞中的分布,發(fā)現(xiàn)TRIM11主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。然后通過(guò)蛋白序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)TRIM11的已知底物Humanin與Bcl2家族蛋白中的MCL1、BCL-2、BCL-XL的BH1結(jié)構(gòu)域具有很高的相似性,并最終使用免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)TRIM11和MCL1能夠相互作用,使用免疫熒光檢測(cè)TRIM
4、11和MCL1在細(xì)胞中定位,發(fā)現(xiàn)兩者共定位于細(xì)胞質(zhì)。
3.檢測(cè)全長(zhǎng)和RING結(jié)構(gòu)域缺失的TRIM11突變體對(duì)細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)RING結(jié)構(gòu)域缺失后,TRIM11抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用消失,說(shuō)明TRIM11發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡功能依賴(lài)于RING結(jié)構(gòu)域。然后檢測(cè)了TRIM11對(duì)外源MCL1蛋白水平的影響,發(fā)現(xiàn)TRIM11可以明顯降低外源MCL1的蛋白水平,并且TRIM11調(diào)節(jié)MCL1蛋白水平依賴(lài)于蛋白酶體途徑
5、。通過(guò)半衰期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TRIM11可以明顯降低外源MCL1和內(nèi)源MCL1的半衰期。最后通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)TRIM11對(duì)MCL1泛素化水平的影響,發(fā)現(xiàn)TRIM11能明顯提高M(jìn)CL1的泛素化水平。
4.使用線粒體熒光標(biāo)記物JC-1檢測(cè)TRIM11對(duì)HeLa細(xì)胞和293T細(xì)胞線粒體膜電位的影響,發(fā)現(xiàn)TRIM11使線粒體膜電位降低,揭示TRIM11主要是通過(guò)影響線粒體功能影響細(xì)胞凋亡的。使用線粒體分離試劑盒分離線粒體并檢測(cè)MCL1、T
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