SFRP2通過(guò)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡及相關(guān)功能的機(jī)制研究.pdf

1、1．研究背景及研究目的創(chuàng)面愈合的理想結(jié)果應(yīng)該是不但恢復(fù)皮膚正常的功能和外觀，而且沒(méi)有生長(zhǎng)增生性瘢痕。但是嚴(yán)重?zé)齻蛣?chuàng)傷后部分個(gè)體經(jīng)常發(fā)生增生性瘢痕，導(dǎo)致功能障礙和外觀改變。增生性瘢痕富含有大量的成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。盡管增生性瘢痕的形成機(jī)制目前還不十分清楚，但是研究表明增生性瘢痕的形成與成纖維細(xì)胞的增殖過(guò)度和凋亡抑制密切相關(guān)。近些年研究發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)基因，如bcl-2，fas，smad3和p53等，參與了成纖維細(xì)胞的增殖與凋亡

2、的調(diào)節(jié)。
　　 前期工作我們利用基因芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)在增生性瘢痕和正常皮膚之間有許多基因表達(dá)存在顯著差異。在我們發(fā)現(xiàn)的97個(gè)差異基因中，SFRP2，一種與凋亡相關(guān)的基因，在增生性瘢痕組織中高表達(dá)。研究顯示SFRP2在心肌修復(fù)，腫瘤發(fā)生過(guò)程中參與了細(xì)胞的增殖與凋亡的調(diào)控。SFRP2是一種分泌型的糖蛋白，被認(rèn)為是wnt信號(hào)的抑制劑，影響細(xì)胞的增殖、凋亡和分化。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的基本過(guò)程是：
　　 配體W

3、nt蛋白結(jié)合細(xì)胞表面受體frizzled（Fz）家族蛋白和LRP5、LRP6，經(jīng)過(guò)一系列過(guò)程導(dǎo)致β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定地積累。轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin與淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子(LEF/ TCF)結(jié)合，調(diào)節(jié)wnt通路靶基因的表達(dá)，如c-myc和cyclin D1等。下游的靶基因參與調(diào)解細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等功能。SFRP2在增生性瘢痕形成過(guò)程中的作用目前尚不清楚。為此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究SFRP2在增生性瘢痕組織中高

4、表達(dá)的意義和相關(guān)wnt信號(hào)通路的作用機(jī)制。
　　 2．方法
　　 2.1組織標(biāo)本和細(xì)胞培養(yǎng)成纖維細(xì)胞由人的正常皮膚組織和增生性瘢痕組織培養(yǎng)獲得。組織標(biāo)本來(lái)自第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院整形科?；颊咧橥?，并報(bào)西南醫(yī)院道德委員會(huì)批準(zhǔn)。
　　 2.2 穩(wěn)定高表達(dá)SFRP2的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的建立從增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中獲得總RNA，利用RT-PCR 技術(shù)獲得SFRP2的cDNA，將目的基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3

5、.0中。然后，將pcDNA3.0/SFRP2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，篩選穩(wěn)定高表達(dá)SFRP2的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞。
　　 2.3 穩(wěn)定低表達(dá)SFRP2的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的建立針對(duì)SFRP2的基因序列設(shè)計(jì)三條shRNA，分別命名為shRNA1、shRNA2和shRNA3。將合成的shRNA 序列克隆到真核表達(dá)載體pSilencer 2.1-U6 neo中。然后，將pSilencer 2.1-U6 neo/SFRP2

6、 shRNA 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，篩選穩(wěn)定低表達(dá)SFRP2的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞。
　　 2.4 SFRP2對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響使用構(gòu)建好的穩(wěn)定高表達(dá)和低表達(dá)SFRP2的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，利用生長(zhǎng)曲線(xiàn)和MTT 方法檢測(cè)SFRP2對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞細(xì)胞活性的影響，進(jìn)而利用BrdU標(biāo)記方法檢測(cè)SFRP2對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響；利用caspase3 活性和Annexin-V FITC/P

7、I分析的方法檢測(cè)SFRP2對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的影響。
　　 2.5 SFRP2 shRNA對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞功能的影響使用構(gòu)建好的穩(wěn)定低表達(dá)SFRP2的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，利用realtime PCR 技術(shù)檢測(cè)成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ前膠原蛋白和肌動(dòng)蛋白α-SMA的mRNA表達(dá)；利用westernblot 檢測(cè)α-SMA的蛋白表達(dá)水平；利用FPCL 體外細(xì)胞模型檢測(cè)SFRP2對(duì)成纖維細(xì)胞體外收縮功能的影響。
　　

8、2.6 SFRP2對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞經(jīng)典wnt信號(hào)通路的調(diào)控首先，利用western blot技術(shù)檢測(cè)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞的經(jīng)典wnt信號(hào)上游關(guān)鍵蛋白wnt1，wnt3a和wnt8b的差異表達(dá)。其次，利用篩選出來(lái)的wnt3a 體外干預(yù)高表達(dá)和低表達(dá)SFRP2的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，利用caspase3 活性和Annexin-V FITC/PI分析的方法檢測(cè)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的變化。最后，利用western

9、blot方法檢測(cè)wnt3a 干預(yù)的高表達(dá)和低表達(dá)SFRP2的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞經(jīng)典wnt信號(hào)通路下游關(guān)鍵蛋白β-catenin和c-myc的表達(dá)。
　　 3 結(jié)論
　　 4.1成功獲得了高表達(dá)和低表達(dá)SFRP2的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞。
　　 4.2在體外，SFRP2 shRNA 促進(jìn)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡，對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖沒(méi)有顯著作用。而SFRP2 過(guò)表達(dá)對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡和增殖的影響

10、均沒(méi)有顯著作用。提示SFRP2 參與調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡，可能是增生性瘢痕形成的機(jī)制之一。
　　 4.3在體外，SFRP2 shRNA 抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)，在基因和蛋白水平抑制α-SMA的表達(dá)，從而抑制體外FPCL 模型收縮。提示SFRP2 參與調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ECM的形成，影響增生性瘢痕的增生與攣縮。
　　 4.4 wnt3a在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于正

11、常皮膚成纖維細(xì)胞。
　　 SFRP2 抑制wnt3a 誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的caspase3 活性和凋亡率。進(jìn)一步研究表明SFRP2能夠顯著地抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞經(jīng)典wnt信號(hào)通路下游關(guān)鍵蛋白β-catenin和c-myc的表達(dá)。提示SFRP2 可能通過(guò)抑制wnt3a/β-catenin信號(hào)通路，調(diào)節(jié)靶基因c-myc的表達(dá)，從而影響增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡。
　　 4.5 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果初步表明SFRP2 調(diào)控增