SFRP2通過經(jīng)典Wnt信號通路調(diào)控增生性瘢痕成纖維細胞凋亡及相關(guān)功能的機制研究.pdf

1、1．研究背景及研究目的創(chuàng)面愈合的理想結(jié)果應(yīng)該是不但恢復(fù)皮膚正常的功能和外觀，而且沒有生長增生性瘢痕。但是嚴重?zé)齻蛣?chuàng)傷后部分個體經(jīng)常發(fā)生增生性瘢痕，導(dǎo)致功能障礙和外觀改變。增生性瘢痕富含有大量的成纖維細胞和細胞外基質(zhì)（ECM）。盡管增生性瘢痕的形成機制目前還不十分清楚，但是研究表明增生性瘢痕的形成與成纖維細胞的增殖過度和凋亡抑制密切相關(guān)。近些年研究發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)基因，如bcl-2，fas，smad3和p53等，參與了成纖維細胞的增殖與凋亡

2、的調(diào)節(jié)。
　　 前期工作我們利用基因芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)在增生性瘢痕和正常皮膚之間有許多基因表達存在顯著差異。在我們發(fā)現(xiàn)的97個差異基因中，SFRP2，一種與凋亡相關(guān)的基因，在增生性瘢痕組織中高表達。研究顯示SFRP2在心肌修復(fù)，腫瘤發(fā)生過程中參與了細胞的增殖與凋亡的調(diào)控。SFRP2是一種分泌型的糖蛋白，被認為是wnt信號的抑制劑，影響細胞的增殖、凋亡和分化。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的基本過程是：
　　 配體W

3、nt蛋白結(jié)合細胞表面受體frizzled（Fz）家族蛋白和LRP5、LRP6，經(jīng)過一系列過程導(dǎo)致β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定地積累。轉(zhuǎn)位到細胞核內(nèi)的β-catenin與淋巴細胞增強因子/T細胞因子(LEF/ TCF)結(jié)合，調(diào)節(jié)wnt通路靶基因的表達，如c-myc和cyclin D1等。下游的靶基因參與調(diào)解細胞的增殖、凋亡和分化等功能。SFRP2在增生性瘢痕形成過程中的作用目前尚不清楚。為此，本實驗旨在研究SFRP2在增生性瘢痕組織中高

4、表達的意義和相關(guān)wnt信號通路的作用機制。
　　 2．方法
　　 2.1組織標本和細胞培養(yǎng)成纖維細胞由人的正常皮膚組織和增生性瘢痕組織培養(yǎng)獲得。組織標本來自第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院整形科。患者知情同意，并報西南醫(yī)院道德委員會批準。
　　 2.2 穩(wěn)定高表達SFRP2的增生性瘢痕成纖維細胞的建立從增生性瘢痕成纖維細胞中獲得總RNA，利用RT-PCR 技術(shù)獲得SFRP2的cDNA，將目的基因克隆到真核表達載體pcDNA3

5、.0中。然后，將pcDNA3.0/SFRP2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到增生性瘢痕成纖維細胞，篩選穩(wěn)定高表達SFRP2的增生性瘢痕成纖維細胞。
　　 2.3 穩(wěn)定低表達SFRP2的增生性瘢痕成纖維細胞的建立針對SFRP2的基因序列設(shè)計三條shRNA，分別命名為shRNA1、shRNA2和shRNA3。將合成的shRNA 序列克隆到真核表達載體pSilencer 2.1-U6 neo中。然后，將pSilencer 2.1-U6 neo/SFRP2

6、 shRNA 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到增生性瘢痕成纖維細胞，篩選穩(wěn)定低表達SFRP2的增生性瘢痕成纖維細胞。
　　 2.4 SFRP2對增生性瘢痕成纖維細胞增殖及凋亡的影響使用構(gòu)建好的穩(wěn)定高表達和低表達SFRP2的增生性瘢痕成纖維細胞，利用生長曲線和MTT 方法檢測SFRP2對增生性瘢痕成纖維細胞細胞活性的影響，進而利用BrdU標記方法檢測SFRP2對增生性瘢痕成纖維細胞增殖的影響；利用caspase3 活性和Annexin-V FITC/P

7、I分析的方法檢測SFRP2對增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的影響。
　　 2.5 SFRP2 shRNA對增生性瘢痕成纖維細胞功能的影響使用構(gòu)建好的穩(wěn)定低表達SFRP2的增生性瘢痕成纖維細胞，利用realtime PCR 技術(shù)檢測成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ前膠原蛋白和肌動蛋白α-SMA的mRNA表達；利用westernblot 檢測α-SMA的蛋白表達水平；利用FPCL 體外細胞模型檢測SFRP2對成纖維細胞體外收縮功能的影響。
　　

8、2.6 SFRP2對增生性瘢痕成纖維細胞經(jīng)典wnt信號通路的調(diào)控首先，利用western blot技術(shù)檢測增生性瘢痕成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞的經(jīng)典wnt信號上游關(guān)鍵蛋白wnt1，wnt3a和wnt8b的差異表達。其次，利用篩選出來的wnt3a 體外干預(yù)高表達和低表達SFRP2的增生性瘢痕成纖維細胞，利用caspase3 活性和Annexin-V FITC/PI分析的方法檢測增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的變化。最后，利用western

9、blot方法檢測wnt3a 干預(yù)的高表達和低表達SFRP2的增生性瘢痕成纖維細胞經(jīng)典wnt信號通路下游關(guān)鍵蛋白β-catenin和c-myc的表達。
　　 3 結(jié)論
　　 4.1成功獲得了高表達和低表達SFRP2的增生性瘢痕成纖維細胞。
　　 4.2在體外，SFRP2 shRNA 促進增生性瘢痕成纖維細胞的凋亡，對增生性瘢痕成纖維細胞的增殖沒有顯著作用。而SFRP2 過表達對增生性瘢痕成纖維細胞的凋亡和增殖的影響

10、均沒有顯著作用。提示SFRP2 參與調(diào)控增生性瘢痕成纖維細胞的凋亡，可能是增生性瘢痕形成的機制之一。
　　 4.3在體外，SFRP2 shRNA 抑制增生性瘢痕成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達，在基因和蛋白水平抑制α-SMA的表達，從而抑制體外FPCL 模型收縮。提示SFRP2 參與調(diào)控增生性瘢痕成纖維細胞ECM的形成，影響增生性瘢痕的增生與攣縮。
　　 4.4 wnt3a在增生性瘢痕成纖維細胞中的表達顯著高于正

11、常皮膚成纖維細胞。
　　 SFRP2 抑制wnt3a 誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細胞的caspase3 活性和凋亡率。進一步研究表明SFRP2能夠顯著地抑制增生性瘢痕成纖維細胞經(jīng)典wnt信號通路下游關(guān)鍵蛋白β-catenin和c-myc的表達。提示SFRP2 可能通過抑制wnt3a/β-catenin信號通路，調(diào)節(jié)靶基因c-myc的表達，從而影響增生性瘢痕成纖維細胞的凋亡。
　　 4.5 本實驗的結(jié)果初步表明SFRP2 調(diào)控增