SIRT4通過ERK-Drp1減少線粒體裂變而抑制肺癌細胞侵襲.pdf

1、背景及目的：
　　肺癌的發(fā)病率和病死率在我國仍然位于第一位，這里主要指非小細胞肺癌。近年來，傳統(tǒng)治療手段（外科手術(shù)、化放療）的不斷改進和完善及新近治療方法（基因治療、分子靶向治療）的不斷探究和實踐使得非小細胞肺癌的治療具有明顯的臨床效果。然而，腫瘤發(fā)展過程中出現(xiàn)的侵襲和轉(zhuǎn)移使得肺癌患者生存率仍然較低。因此，探索腫瘤惡性進展的分子機制，尋找治療的方法是臨床延長肺癌患者生存時間和改善生存質(zhì)量的關(guān)鍵。
　　Sirtuins（SIR

2、T1-7）蛋白家族是高度保守的具有NAD依賴的去乙酰化酶活性和/或ADP依賴的核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的一類蛋白質(zhì)。由于成員分布的不同位置，其下游分子蛋白可以分布在細胞核、細胞漿或線粒體，通過其酶的活性參與細胞代謝、應激反應和癌變。Sirtuin4作為該家族成員，與Sirtuin3和Sirtuin5一樣定位于線粒體，而發(fā)揮與Sirtuin6類似的ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性。最初，SIRT4被認為與維持基因組穩(wěn)定性和調(diào)控細胞代謝有關(guān)。最近的研究表明，

3、SIRT4作為腫瘤抑制基因可以通過抑制谷氨酰胺代謝進而抑制細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)化。臨床meta分析結(jié)果表明SIRT4的mRNA水平在包括肺癌在內(nèi)的許多惡性腫瘤中呈現(xiàn)低表達。而且，SIRT4基因敲除小鼠可自發(fā)形成各種實體腫瘤，其中最常見的是肺部腫瘤。此外，SIRT4表達減少與乳腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌的侵襲性密切相關(guān)。
　　線粒體持續(xù)不斷的進行聚變和裂變的過程是維持細胞生命過程（包括細胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤生長）所必須的。聚變和裂變受

4、到相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白分子的嚴格調(diào)控，這些關(guān)鍵分子蛋白包括:Mfn1/2和OPA1等促線粒體聚變分子和DRP1和Fis1等促線粒體裂變相關(guān)分子。研究報道指出，線粒體功能失調(diào)能夠增加腫瘤發(fā)生發(fā)展的可能性，包括肺癌。Drp1的上調(diào)和Mfn的下調(diào)會導致線粒體裂變增加、聚變減少，進而促進肺癌細胞增殖，減少細胞凋亡。
　　盡管有證據(jù)表明SIRT4在肺癌中作為抑癌基因發(fā)揮作用，但其在肺癌組織中的表達尚未見報道。同時，SIRT4是否在肺癌細胞線粒體動力

5、學中發(fā)揮作用也尚不清楚。我們的研究證實，SIRT4蛋白在非小細胞肺癌中低表達，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理因素和不良預后有關(guān)。此外，我們在肺癌細胞中研究了其對線粒體動力學的影響，并發(fā)現(xiàn)SIRT4通過ERK-DRP1通路抑制肺癌細胞侵襲能力。
　　方法：
　　一、檢測SIRT4蛋白在肺癌組織中的作用
　　1、免疫組化染色方法檢測SIRT4在133例肺癌標本中的表達情況。
　　2、統(tǒng)計分析SIRT4的表達情況及其與臨床

6、病理因素、增殖指數(shù)Ki-67及預后的關(guān)系。
　　二、檢測SIRT4在肺癌細胞生物學中的作用
　　1、western blot和real-time PCR檢測SIRT4在HBE和一系列肺癌細胞系中的蛋白水平和RNA水平。
　　2、選擇SIRT4相對低表達的肺癌細胞系進行SIRT4質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，SIRT4相對高表達的肺癌細胞系進行siRNA SIRT4序列的轉(zhuǎn)染，48小時后檢測細胞內(nèi)SIRT4蛋白和RNA水平的變化。

7、　　3、利用MTT細胞增殖實驗、克隆形成實驗檢測SIRT4對肺癌細胞增殖能力的影響。
　　4、利用流式細胞儀檢測SIRT4對肺癌細胞周期的影響。
　　5、利用劃痕實驗和基質(zhì)膠侵襲實驗檢測SIRT4對肺癌細胞遷移和侵襲的影響。
　　三、探討SIRT4調(diào)節(jié)細胞侵襲的分子機制
　　1、檢測SIRT4對線粒體動態(tài)平衡的影響
　　(1)利用線粒體熒光探針檢測SIRT4的細胞定位情況。
　　(2)免疫熒光共聚焦檢

8、測SIRT4對線粒體動態(tài)平衡的影響。
　　2、檢測SIRT4影響線粒體動態(tài)平衡的關(guān)鍵分子
　　(1)western blot篩查SIRT4對線粒體動態(tài)平衡相關(guān)因子的作用。
　　(2)免疫熒光檢測關(guān)鍵因子的變化情況。
　　(3)免疫共沉淀檢測相關(guān)因子的相互作用。
　　3、檢測SIRT4是如何調(diào)控線粒體動態(tài)平衡分子
　　(1)western blot檢測SIRT4對MAPK信號通路的作用。
　　(2

9、)使用抑制劑PD98059檢測線粒體動態(tài)平衡的作用。
　　4、檢測SIRT4是否是通過線粒體動態(tài)平衡調(diào)節(jié)肺癌細胞侵襲能力
　　(1)使用線粒體裂變抑制劑Mdivi-1檢測SIRT4對肺癌細胞線粒體裂變和細胞侵襲能力的影響。
　　(2)使用抑制劑PD98059檢測SIRT4對線粒體裂變和細胞侵襲能力的影響。
　　四、免疫組化檢測SIRT4和線粒體動態(tài)平衡相關(guān)因子在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達情況
　　選擇具有

10、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的60例肺癌組織組織進行SIRT4和p-Drp1的在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中免疫組化染色，檢測SIRT4和p-Drp1的表達情況及驗證SIRT4是否負調(diào)控p-Drp1。
　　五、體內(nèi)實驗
　　用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染H1299過表達SIRT4的肺癌細胞系，進行裸鼠成瘤實驗，每4-7天檢測腫瘤大小。2個月后取出腫瘤組織進行石蠟包埋切片SIRT4和p-Drp1的免疫組化染色，提取腫瘤組織蛋白和RNA后在體內(nèi)檢測SIRT4對p-Drp

11、1的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　一、SIRT4在肺癌組織中發(fā)揮抑癌作用
　　1、SIRT4在正常肺組織中位于細胞漿呈陽性表達，而在52.6％(70/133)的肺癌組織中呈陰性表達。
　　2、SIRT4低表達與腺癌、TNM分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和增殖指數(shù)Ki-67有關(guān)，重要的是SIRT4陰性表達患者的生存率明顯低于SIRT4陽性表達的肺癌患者。
　　二、SIRT4在肺癌細胞中發(fā)揮抑癌作用
　　1、在

12、H1299和A549中上調(diào)SIRT4能夠明顯抑制肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，且能夠阻滯細胞周期進展。
　　2、在H460和LK2中減少SIRT4的表達明顯增加肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，且能夠促進細胞周期進展。
　　三、SIRT4抑制肺癌細胞侵襲的分子機制
　　1、SIRT4抑制肺癌細胞線粒體裂變。
　　2、SIRT4通過抑制Drp1磷酸化進而抑制線粒體裂變。
　　3、SIRT4通過ERK-Drp1

13、抑制線粒體裂變進而抑制肺癌細胞侵襲。
　　四、S IRT4和p-Drp1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中和對應原發(fā)灶中的表達相關(guān)性
　　1、SIRT4在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤中的表達比相應的原發(fā)性腫瘤低。
　　2、在原發(fā)性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性腫瘤中，SIRT4與p-Drp1表達呈負相關(guān)關(guān)系。
　　五、體內(nèi)實驗
　　SIRT4抑制裸鼠肺部腫瘤的生長，并且負向調(diào)控Drp1的蛋白和RNA水平的表達。
　　結(jié)論：
　　1.SIRT4在