SIRT4通過ERK-Drp1減少線粒體裂變而抑制肺癌細(xì)胞侵襲.pdf

1、背景及目的：
　　肺癌的發(fā)病率和病死率在我國(guó)仍然位于第一位，這里主要指非小細(xì)胞肺癌。近年來，傳統(tǒng)治療手段（外科手術(shù)、化放療）的不斷改進(jìn)和完善及新近治療方法（基因治療、分子靶向治療）的不斷探究和實(shí)踐使得非小細(xì)胞肺癌的治療具有明顯的臨床效果。然而，腫瘤發(fā)展過程中出現(xiàn)的侵襲和轉(zhuǎn)移使得肺癌患者生存率仍然較低。因此，探索腫瘤惡性進(jìn)展的分子機(jī)制，尋找治療的方法是臨床延長(zhǎng)肺癌患者生存時(shí)間和改善生存質(zhì)量的關(guān)鍵。
　　Sirtuins（SIR

2、T1-7）蛋白家族是高度保守的具有NAD依賴的去乙?；富钚院?或ADP依賴的核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的一類蛋白質(zhì)。由于成員分布的不同位置，其下游分子蛋白可以分布在細(xì)胞核、細(xì)胞漿或線粒體，通過其酶的活性參與細(xì)胞代謝、應(yīng)激反應(yīng)和癌變。Sirtuin4作為該家族成員，與Sirtuin3和Sirtuin5一樣定位于線粒體，而發(fā)揮與Sirtuin6類似的ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性。最初，SIRT4被認(rèn)為與維持基因組穩(wěn)定性和調(diào)控細(xì)胞代謝有關(guān)。最近的研究表明，

3、SIRT4作為腫瘤抑制基因可以通過抑制谷氨酰胺代謝進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)化。臨床meta分析結(jié)果表明SIRT4的mRNA水平在包括肺癌在內(nèi)的許多惡性腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)。而且，SIRT4基因敲除小鼠可自發(fā)形成各種實(shí)體腫瘤，其中最常見的是肺部腫瘤。此外，SIRT4表達(dá)減少與乳腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌的侵襲性密切相關(guān)。
　　線粒體持續(xù)不斷的進(jìn)行聚變和裂變的過程是維持細(xì)胞生命過程（包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤生長(zhǎng)）所必須的。聚變和裂變受

4、到相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白分子的嚴(yán)格調(diào)控，這些關(guān)鍵分子蛋白包括:Mfn1/2和OPA1等促線粒體聚變分子和DRP1和Fis1等促線粒體裂變相關(guān)分子。研究報(bào)道指出，線粒體功能失調(diào)能夠增加腫瘤發(fā)生發(fā)展的可能性，包括肺癌。Drp1的上調(diào)和Mfn的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致線粒體裂變?cè)黾?、聚變減少，進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡。
　　盡管有證據(jù)表明SIRT4在肺癌中作為抑癌基因發(fā)揮作用，但其在肺癌組織中的表達(dá)尚未見報(bào)道。同時(shí)，SIRT4是否在肺癌細(xì)胞線粒體動(dòng)力

5、學(xué)中發(fā)揮作用也尚不清楚。我們的研究證實(shí)，SIRT4蛋白在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理因素和不良預(yù)后有關(guān)。此外，我們?cè)诜伟┘?xì)胞中研究了其對(duì)線粒體動(dòng)力學(xué)的影響，并發(fā)現(xiàn)SIRT4通過ERK-DRP1通路抑制肺癌細(xì)胞侵襲能力。
　　方法：
　　一、檢測(cè)SIRT4蛋白在肺癌組織中的作用
　　1、免疫組化染色方法檢測(cè)SIRT4在133例肺癌標(biāo)本中的表達(dá)情況。
　　2、統(tǒng)計(jì)分析SIRT4的表達(dá)情況及其與臨床

6、病理因素、增殖指數(shù)Ki-67及預(yù)后的關(guān)系。
　　二、檢測(cè)SIRT4在肺癌細(xì)胞生物學(xué)中的作用
　　1、western blot和real-time PCR檢測(cè)SIRT4在HBE和一系列肺癌細(xì)胞系中的蛋白水平和RNA水平。
　　2、選擇SIRT4相對(duì)低表達(dá)的肺癌細(xì)胞系進(jìn)行SIRT4質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，SIRT4相對(duì)高表達(dá)的肺癌細(xì)胞系進(jìn)行siRNA SIRT4序列的轉(zhuǎn)染，48小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SIRT4蛋白和RNA水平的變化。

7、　　3、利用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SIRT4對(duì)肺癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　4、利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SIRT4對(duì)肺癌細(xì)胞周期的影響。
　　5、利用劃痕實(shí)驗(yàn)和基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SIRT4對(duì)肺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。
　　三、探討SIRT4調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制
　　1、檢測(cè)SIRT4對(duì)線粒體動(dòng)態(tài)平衡的影響
　　(1)利用線粒體熒光探針檢測(cè)SIRT4的細(xì)胞定位情況。
　　(2)免疫熒光共聚焦檢

8、測(cè)SIRT4對(duì)線粒體動(dòng)態(tài)平衡的影響。
　　2、檢測(cè)SIRT4影響線粒體動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵分子
　　(1)western blot篩查SIRT4對(duì)線粒體動(dòng)態(tài)平衡相關(guān)因子的作用。
　　(2)免疫熒光檢測(cè)關(guān)鍵因子的變化情況。
　　(3)免疫共沉淀檢測(cè)相關(guān)因子的相互作用。
　　3、檢測(cè)SIRT4是如何調(diào)控線粒體動(dòng)態(tài)平衡分子
　　(1)western blot檢測(cè)SIRT4對(duì)MAPK信號(hào)通路的作用。
　　(2

9、)使用抑制劑PD98059檢測(cè)線粒體動(dòng)態(tài)平衡的作用。
　　4、檢測(cè)SIRT4是否是通過線粒體動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞侵襲能力
　　(1)使用線粒體裂變抑制劑Mdivi-1檢測(cè)SIRT4對(duì)肺癌細(xì)胞線粒體裂變和細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　(2)使用抑制劑PD98059檢測(cè)SIRT4對(duì)線粒體裂變和細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　四、免疫組化檢測(cè)SIRT4和線粒體動(dòng)態(tài)平衡相關(guān)因子在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況
　　選擇具有

10、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的60例肺癌組織組織進(jìn)行SIRT4和p-Drp1的在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中免疫組化染色，檢測(cè)SIRT4和p-Drp1的表達(dá)情況及驗(yàn)證SIRT4是否負(fù)調(diào)控p-Drp1。
　　五、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染H1299過表達(dá)SIRT4的肺癌細(xì)胞系，進(jìn)行裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，每4-7天檢測(cè)腫瘤大小。2個(gè)月后取出腫瘤組織進(jìn)行石蠟包埋切片SIRT4和p-Drp1的免疫組化染色，提取腫瘤組織蛋白和RNA后在體內(nèi)檢測(cè)SIRT4對(duì)p-Drp

11、1的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　一、SIRT4在肺癌組織中發(fā)揮抑癌作用
　　1、SIRT4在正常肺組織中位于細(xì)胞漿呈陽性表達(dá)，而在52.6％(70/133)的肺癌組織中呈陰性表達(dá)。
　　2、SIRT4低表達(dá)與腺癌、TNM分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和增殖指數(shù)Ki-67有關(guān)，重要的是SIRT4陰性表達(dá)患者的生存率明顯低于SIRT4陽性表達(dá)的肺癌患者。
　　二、SIRT4在肺癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用
　　1、在

12、H1299和A549中上調(diào)SIRT4能夠明顯抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，且能夠阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展。
　　2、在H460和LK2中減少SIRT4的表達(dá)明顯增加肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，且能夠促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展。
　　三、SIRT4抑制肺癌細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制
　　1、SIRT4抑制肺癌細(xì)胞線粒體裂變。
　　2、SIRT4通過抑制Drp1磷酸化進(jìn)而抑制線粒體裂變。
　　3、SIRT4通過ERK-Drp1

13、抑制線粒體裂變進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞侵襲。
　　四、S IRT4和p-Drp1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中和對(duì)應(yīng)原發(fā)灶中的表達(dá)相關(guān)性
　　1、SIRT4在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤中的表達(dá)比相應(yīng)的原發(fā)性腫瘤低。
　　2、在原發(fā)性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性腫瘤中，SIRT4與p-Drp1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　五、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　SIRT4抑制裸鼠肺部腫瘤的生長(zhǎng)，并且負(fù)向調(diào)控Drp1的蛋白和RNA水平的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.SIRT4在