改良多重實(shí)時熒光PCR技術(shù)定量檢測DNA甲基化.pdf

1、DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一種，在維持胚胎發(fā)育、基因印記、正常細(xì)胞功能以及人類疾病發(fā)生中起著重要作用。檢測DNA甲基化對疾病特別是腫瘤進(jìn)行早期診斷、預(yù)后分析、合理用藥等有重要的臨床意義。因此快速準(zhǔn)確、操作簡便、成本低廉的分析技術(shù)是甲基化研究及臨床檢測所必需的。 本文綜合比較了不同的DNA甲基化檢測技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)后以及在臨床檢測的可行性，提出了改良多重實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(HANDs-qMSP)，并利用該技術(shù)檢測64份大腸癌標(biāo)本

2、及其正常對照的CpG島甲基化表型(CIMP)，包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50，利用HANDs-qMSP技術(shù)對64份大腸癌組織及64份與之對應(yīng)正常對照進(jìn)行臨床評估，結(jié)果顯示，CIMP中至少有一個基因發(fā)生甲基化的概率為85.94％(55/64)，其中RUNX3. APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50的甲基化陽性率分別為7.81％(5/64)、15.63％(10/64)、29.69％(19/64)、6

3、5.63％(42/64)、54.69％(35/64)，特異性分別為100.00％(64/64)、98.44％(63/64)、96.88％(62/64)、90.62％(58/64)、83.74％(54/64)。與普通多重實(shí)時熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)的基于MethyLight發(fā)展起來的技術(shù)相比，HANDs-qMSP技術(shù)具有以下幾個優(yōu)點(diǎn)：(1) HANDs-qMSP技術(shù)設(shè)置了一份98％質(zhì)控管，該質(zhì)控管不僅可以作為100％陽性對照，還可作為亞硫

4、酸鹽轉(zhuǎn)化效率為98％的指標(biāo)，用于指示標(biāo)本亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率的高低，從而有效避免由亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率太低所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。(2)HANDs-qMSP技術(shù)采用了同源加尾(HAND)系統(tǒng)，HAND系統(tǒng)能有效地抑制引物二聚體的產(chǎn)生，減小多重PCR體系中各基因間擴(kuò)增效率的差異，提高相對定量的精確度。本論文所建立的HANDs-qMSP體系最低可檢測到10pg/反應(yīng)，且能精確定量至0.01％。同時HANDs-qMSP是多重PCR體系，在同一反應(yīng)管中可同