應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測腸球菌的研究.pdf

1、目的：腸道菌群存在于宿主腸道之內(nèi)，可以視為人體正常的器官，其數(shù)量之大(10<'14>)、種類之多(300-500種)，不容人們對其忽視，這些細(xì)菌直接參與宿主的物質(zhì)代謝，是宿主正常生理活動中不可缺少的重要組成部分。腸球菌雖然不是腸道中數(shù)量最多的細(xì)菌，但已證實(shí)其在腸道中具有一定的生理功能。內(nèi)源性腸球菌主要定植于回腸和結(jié)腸部位，影響宿主腸道的消化吸收及其他功能?，F(xiàn)已經(jīng)從健康人中分離出具有生理功能的腸球菌<'[0，7]>，并已在動物體內(nèi)及人體內(nèi)

2、證實(shí)腸球菌具有降低人及動物膽固醇和甘油三酯水平的作用。目前，市場中已有腸球菌作為調(diào)血脂的藥品和保健食品上市，所以了解腸球菌在宿主體內(nèi)的數(shù)量以及在服用腸球菌制劑前后宿主體內(nèi)腸球菌的狀況是十分重要的。目前用含疊氮鈉成分的培養(yǎng)基定量檢測腸球菌是其主要方法。常規(guī)的培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法需要1-2天的時(shí)間，費(fèi)時(shí)費(fèi)力<'[2]>，且細(xì)菌在不良環(huán)境中(低溫、低養(yǎng)分、HClO等條件下)處于細(xì)菌的活的非可培養(yǎng)狀態(tài)<'[8]>(VBNS)，使常規(guī)的計(jì)數(shù)方法具有局限性

3、；在提取DNA基礎(chǔ)上建立的普通PCR方法只能定性和半定量。近年來，定量PCR方法應(yīng)用于檢測復(fù)雜微生物環(huán)境中細(xì)菌、病毒具有更高的靈敏性和特異性。熒光定量PCR主要分為SYBR GreenI熒光定量PCR和TaqMan熒光定量PCR，各有優(yōu)缺點(diǎn)。本研究對SYBR GreenI熒光定量PCR．和TaqMan熒光定量PCR兩種方法檢測腸球菌做出了初步探索，目的是建立快速準(zhǔn)確定量腸球菌的方法。 方法：實(shí)驗(yàn)分兩部分：第一部分：根據(jù)GeneB

4、ank發(fā)表的腸球菌23SrDNA保守基因序列設(shè)計(jì)合成了一對引物和探針，利用普通PCR方法從細(xì)菌基因組中擴(kuò)增出目的基因，并連入載體pMD18-T載體中，制成陽性質(zhì)粒作為靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品。對熒光定量PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了TaqMan熒光定量PCR檢測方法。將樣本處理后，經(jīng)過DNA提取純化步驟，定量樣本中的腸球菌，并且比較TaqMan熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)的培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法定量結(jié)果的差異。第二部分：根據(jù)GeneBank發(fā)表的腸球菌23S

5、rDNA保守基因序列設(shè)計(jì)合成了一對引物，利用普通PCR方法從細(xì)菌基因組中擴(kuò)增出目的基因，并連入載體pMD18-T載體中，制成陽性質(zhì)粒作為靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品。對熒光定量PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了SYBR GreenI熒光定量PCR檢測方法。將樣本經(jīng)過處理后，經(jīng)過DNA提取純化步驟，定量樣本中的腸球菌。并且比較SYBR GreenI熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)的培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法定量結(jié)果的差異。結(jié)果：所建立的TaqMan熒光定量PCR方法靈敏度可達(dá)

6、6個(gè)拷貝數(shù)/reaction，所建立的SYBRGreenI熒光定量PCR方法靈敏度也可達(dá)7個(gè)拷貝數(shù)/reaction。糞便樣本根據(jù)兩種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法所得的理論數(shù)值與培養(yǎng)菌值之間無顯著性差異(P>0.05)。根據(jù)熒光定量PCR．方法非炎性腹瀉標(biāo)本中菌數(shù)與健康成人標(biāo)本中菌數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。兩種定量PCR方法所得菌數(shù)之間無顯著性差異(P>0.05)。靈敏度曲線所得的數(shù)值大于菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可能由于DNA提取過程中存在部分的