應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合DNA直接測(cè)序技術(shù)檢測(cè)PINK1基因突變.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢(shì)步態(tài)異常等，病理以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的喪失和路易氏小體(Lewy Body)的形成為特點(diǎn)，約10-15﹪的PD患者有家族史。常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征(autosomal recessiveearly-onset parkinsonism，AREP)是指除符合帕金森病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)以外，遺傳方式呈常染色體

2、隱性遺傳，發(fā)病年齡≤45歲的帕金森綜合征；其發(fā)病可能與Parkin基因，PINK1基因，DJ-1基因和ATP13A2基因突變有關(guān)。多巴反應(yīng)性肌張力障礙(Dopamine Reacted Dystonia，DRD)是指對(duì)小劑量左旋多巴有顯著性和持續(xù)性反應(yīng)的肌張力障礙，其主要致病基因?yàn)镚CH-1基因和TH基因。由于DRD臨床表現(xiàn)可能與發(fā)病年齡更早的AREP相似，其基因診斷和分子分型是必須的。 國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)PINKJ1基因進(jìn)行突變分

3、析，發(fā)現(xiàn)除點(diǎn)突變、小片段缺失或/和插入突變以外，還發(fā)現(xiàn)PINK1基因存在外顯子重排突變。對(duì)于呈雜合狀態(tài)的外顯子缺失突變及呈雜合或純合狀態(tài)的重復(fù)突變，DNA直接測(cè)序常常不能檢出，因此為全面檢測(cè)PINK1基因突變，目前國(guó)外普遍采用熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合：DNA直接測(cè)序技術(shù)對(duì)PINK1基因進(jìn)行突變檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)僅有張玉虎等用DNA直接測(cè)序法對(duì)PINK1基因進(jìn)行突變檢測(cè)的報(bào)道，尚未見用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PINK1基因突變的報(bào)道。

4、 本文建立并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PINK1基因外顯子重排突變的技術(shù)平臺(tái)，結(jié)合DNA直接測(cè)序方法對(duì)本組21個(gè)AREP家系和6個(gè)DRD家系先證者進(jìn)行PINK1基因突變分析。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PINK1基因外顯子重排突變，結(jié)合DNA直接測(cè)序技術(shù)檢測(cè)PINK1基因點(diǎn)突變、小片段插入或/和缺失突變。設(shè)置ALB基因?yàn)閮?nèi)對(duì)照，建立PINK1基因和ALB基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PINK1基因和ALB基因相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的起

5、始拷貝數(shù)，PINK1基因相對(duì)拷貝數(shù)為PINK1基因相對(duì)起始拷貝數(shù)與ALB基因相對(duì)起始拷貝數(shù)的比值。結(jié)果應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)21個(gè)AREP家系和6個(gè)DRD家系先證者進(jìn)行PINK1基因外顯子重排突變檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PINK1基因各外顯子相對(duì)拷貝數(shù)均在0.8-1.2之間，在目前公認(rèn)的正常參考范圍之內(nèi)，提示本組患者不存在PINK1基因各外顯子的重排突變；在前期工作的基礎(chǔ)上，應(yīng)用DNA直接測(cè)序法對(duì)5個(gè)AREP家系和3個(gè)DRD家系先證者進(jìn)行PIN

6、K1基因點(diǎn)突變、小片段插入或/和缺失突變檢測(cè)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PINK1基因的致病突變，發(fā)現(xiàn)5個(gè)單核苷酸多態(tài)(SNPs)：c．189C→T．c．1018G→A，c．1023G→A，c．1562A→C和3’-UTR37a→t，均為已報(bào)道SNPs。 研究結(jié)論：建立了應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PINK1基因外顯子重排突變的技術(shù)平臺(tái)，未發(fā)現(xiàn)本組患者存在PINK1基因各外顯子重排突變；發(fā)現(xiàn)了本組患者PINK1基因的5個(gè)單核苷酸多態(tài)：c．189C→