益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)中藥對高糖培養(yǎng)足細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子及其受體的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎臟?。―iabetic kidney disease, DKD）是糖尿病患者代謝紊亂引起的腎小球硬化癥。DKD患者病情發(fā)展為顯性腎病后最終轉(zhuǎn)歸是進(jìn)展為終末期腎臟病（ESRD）。DKD發(fā)病的早期事件如腎小球肥大、微量白蛋白尿（MA）等與足細(xì)胞損傷密切相關(guān)，另外其與腎小球硬化、腎功能下降也有一定關(guān)系。發(fā)現(xiàn)最早的DKD的主要病理變化是腎臟系膜基質(zhì)增多和腎小球基底膜增厚。足細(xì)胞損傷在DKD發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，具有窗狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮

2、細(xì)胞是構(gòu)成腎小球濾過屏障的第一道防線。既往有研究發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)條件可刺激足細(xì)胞合成和分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）增多，還能引發(fā)足細(xì)胞凋亡、脫落，最終使足細(xì)胞的數(shù)量減少， VEGF的過表達(dá)會導(dǎo)致腎小球濾過膜的通透性增加，經(jīng)濾過膜濾出的血漿白蛋白病理性增多，引發(fā)蛋白尿的形成。本研究觀察益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)中藥對大鼠VEGF及Flt-1表達(dá)的影響，研究其對于糖尿病腎病的治療效應(yīng)。
　　方法：
　　1.益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)中藥藥物血清及

3、正常鼠血清制備
　　健康雄性SD大鼠，SPF級，12只，體重200-220g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心，動物合格證編號1404079。將大鼠隨機(jī)分為4組：正常組、低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組。正常組給予同等劑量的生理鹽水，其余三組根據(jù)Meeh-Rubner[1-2]公式以低劑量組為臨床半量、中劑量組為臨床用量、高劑量組為兩倍臨床用量折算藥物灌胃劑量，所用中藥為中藥免煎顆粒，購于河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省中醫(yī)院中藥房。方

4、藥組成如下：地龍、鱉甲、丹參、大黃、僵蠶、烏梢蛇、水蛭、黃芪、玄參、熟地、山萸肉。每只大鼠灌胃劑量2ml，每12h給藥一次，連續(xù)灌胃3d，最后一次灌胃1~2h后進(jìn)行心臟無菌取血，4500r/min離心10min將血清分離56℃水浴滅活30min，0.22μm無菌濾過膜過濾2次，-20℃凍存。
　　2.小鼠足細(xì)胞的培養(yǎng)以及益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)中藥血清對高糖環(huán)境下足細(xì)胞VEGF、Flt-1表達(dá)的影響
　　永生化小鼠足細(xì)胞在33℃，γ

5、-IFN許可條件下培養(yǎng)，細(xì)胞密度融合至80％左右給予傳代，隨后在37℃，無γ-IFN的非許可條件下傳代培養(yǎng)10-14天使足細(xì)胞分化成熟。隨后將足細(xì)胞分為6組：正常對照組（ Normal Control，NC）、高糖組（High Glucose，HG）、正常鼠血清組（Normal Rat， NR）、低劑量中藥血清組（Low dose of drug，LD）、中劑量中藥血清組（Normal dose of drug，ND）、高劑量中藥血清組

6、（High dose of drug， HD）,NC組細(xì)胞給予培養(yǎng)基含有D-glucose5.5mmol/L+5%胎牛血清，HG組給予培養(yǎng)基含有D-glucose30mmol/L+5%胎牛血清，NR組給予培養(yǎng)基含有D-glucose30mmol/L+5%胎牛血清+5%正常鼠血清，LD組給予培養(yǎng)基含有D-glucose30mmol/L+5%胎牛血清+5%低劑量中藥血清組，ND組給予培養(yǎng)基含有 D-glucose30mmol/L+5%胎牛血

7、清+5%中劑量中藥血清組，HD組給予培養(yǎng)基含有D-glucose30mmol/L+5%胎牛血清+5%高劑量中藥血清組。各組刺激24h后，收集足細(xì)胞應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法、western blot、Real-time PCR檢測VEGF、Flt-1 mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：VEGF、Flt-1在高糖組和正常鼠血清組小鼠足細(xì)胞均可見明顯的陽性表達(dá)，中藥血清刺激的小鼠足細(xì)胞 VEGF、Flt-1在蛋白水平和mRNA水平均較高糖組和