血管內皮生長因子基因轉染血管內皮祖細胞治療肢體缺血.pdf

1、研究背景和目的：隨著人們飲食習慣的改變、生活水平的提高以及壽命的延長，外周動脈疾病的發(fā)病率逐年升高，尤其是下肢缺血性疾病已經(jīng)成為危害人類健康的嚴重疾病。目前針對下肢缺血性疾病主要手段是藥物、外科手術以、腔內治療等。但是對于遠端流出道嚴重狹窄尤其是合并糖尿病的患者往往沒有手術機會，目前還缺乏令人滿意的治療方法。應用各種方法和手段促進新生血管生成，促進缺血肢體側枝循環(huán)的建立，是有效可行的研究方向之一。干細胞治療和基因治療是目前治療缺血性疾病

2、的兩大熱點。 干細胞是一類具有無限的或者永生的自我更新能力的細胞，能夠產(chǎn)生至少一種類型的、高度分化的子細胞。一般來說，在干細胞和其終末分化的子代細胞之間存在著被稱為“定向祖細胞”的中間祖細胞群，它們具有有限的擴增能力和限制性分化潛能。在體外，干細胞具有自我更新及分化成器官特定的細胞類型的能力，當置于體內，在適當?shù)沫h(huán)境下則能重構器官系統(tǒng)。對干細胞進行定向誘導分化，獲取血管內皮祖細胞(EPCs)并以適當?shù)姆绞揭浦驳襟w內，則有望在機體

3、的血管新生中發(fā)揮重要作用。而VEGF基因的治療性血管新生作用也已經(jīng)得到證實。VEGF能增加小血管的通透性、促進內皮細胞增殖和遷移，抑制內皮細胞凋亡，并能刺激內皮細胞產(chǎn)生纖溶酶原激活物，從而有力地促進血管新生。 與成體組織相比，干細胞移植的優(yōu)勢之一即在于其易于改造，可以作為基因治療良好的靶細胞。因此將干細胞治療與基因(如VEGF)治療聯(lián)系起來治療缺血性疾病是一種有前途的方法。因此，我們設想利用血管內皮祖細胞作為VEGF基因的載體，

4、同時發(fā)揮干細胞及VEGF的促血管新生作用來改善缺血肢體的血供。本實驗提取新西蘭兔骨髓單個核細胞在體外誘導分化成血管內皮祖細胞，然后體外行VEGF165基因轉染，移植到下肢缺血的新西蘭兔體內，觀測其促進血管新生，改善肢體缺血的效果。為干細胞及基因治療在缺血性疾病的臨床應用提供實驗依據(jù)。 研究內容和方法1.新西蘭兔髂嵴穿刺抽取骨髓，F(xiàn)icoll離心液梯度離心分離骨髓單個核細胞，然后用含有VEGF、bFGF、IGF-1的M199培養(yǎng)液

5、誘導培養(yǎng)EPCs，探索誘導分化所需要的誘導劑量、接種密度等條件。 2.光鏡觀察在誘導分化過程中細胞形態(tài)的變化，觀察是否有內皮細胞的特征性變化。掃描電鏡及透射電鏡觀察所培養(yǎng)細胞的超微結構。應用血管內皮細胞特異性抗體vWF抗體及CD133抗體行間接免疫熒光實驗，從不同角度對所培養(yǎng)細胞進行鑒定。 3.用攜帶VEGF基因的腺病毒質粒轉染所培養(yǎng)的細胞，觀察不同轉染比率對細胞增殖的影響，探索合適的轉染比率。 4.以MTT法觀

6、察攜帶VEGF基因的腺病毒質粒轉染對于培養(yǎng)細胞增殖能力的影響；雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測上清液中VEGF蛋白的表達情況。 5.制作新西蘭兔后肢缺血模型，結扎切斷股動脈主干及其主要分支，觀察術后實驗兔的皮溫等體征變化，并行CTA檢查檢測缺血效果。 6.將后肢缺血的新西蘭兔隨機分為A、B、C三組，缺血肢體肌肉注射行細胞移植。A組注射EPCs；B組注射VEGF165基因轉染后的EPCs；C組注射M199培養(yǎng)基，行下肢C

7、TA檢查，觀察缺血肢體側枝循環(huán)建立及血供改善情況，并取患肢腓腸肌做石蠟切片，計數(shù)新生毛細血管數(shù)目。觀察移植術后各組新西蘭兔皮溫及其他癥狀、體征的變化。 7.部分培養(yǎng)細胞Brdu標記后移植，患肢腓腸肌做冰凍切片應用Brdu抗體行免疫組化實驗，觀測移植細胞是否整合到缺血局部。 研究結果1.血管內皮祖細胞的誘導分化、培養(yǎng)擴增及鑒定兔骨髓單個核細胞誘導培養(yǎng)48～72h后即可見有細胞貼壁，貼壁細胞逐漸增多，并逐漸變成梭形。培養(yǎng)至8

8、天左右，可觀察到數(shù)條由梭形貼壁細胞直線生長連接而成的條索，為內皮細胞的特征。7～10天出現(xiàn)多個細胞團，貼壁的梭形細胞開始從細胞團的邊緣出芽長出，這種結構類似血島。培養(yǎng)至14天左右，細胞逐漸融合，連接成大片條索狀結構。透射電鏡觀察細胞內可見細胞核、線粒體、空泡，并可見多個吞飲泡，為內皮細胞特征性結構，細胞邊緣可見微絨毛。vWF抗體作一抗，F(xiàn)ITC標記二抗，熒光顯微鏡下可見梭形細胞發(fā)出綠色熒光，CD133抗體作一抗，TRITC標記二抗，熒光

9、顯微鏡下可見梭形細胞發(fā)出紅色熒光，證實所培養(yǎng)細胞為血管內皮祖細胞。 2.Adv-GFP-VEGF165基因轉染EPCs結果轉染攜帶綠色熒光蛋白表達基因的Adv-GFP-VEGF165后24h在熒光顯微鏡下觀察，見幾乎所有細胞呈綠色熒光，說明轉染成功。增殖實驗及細胞形態(tài)觀察證實1∶50是合適的轉染比率。MTT實驗觀察轉染Adv-GFP-VEGF165后EPCs的增殖未受影響。雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測轉染VEGF165后的

10、EPCs其上清液中VEGF蛋白濃度明顯升高。 3.細胞移植實驗結果移植后各組CTA顯示EPCs組及VEGF基因轉染的EPCs組有較多的側枝循環(huán)建立，均明顯好于對照組，而VEGF基因轉染的EPCs組又好于EPCs組。免疫組化結果與之相似，各組之間新生毛細血管數(shù)目均有顯著性差異(P＜0.01)，以VEGF基因轉染的EPCs組新生毛細血管數(shù)目最多，高于EPCs組，而后者又明顯高于對照組。EPCs移植組及VEGF基因轉染的EPCs組移植

11、后第14d、28d兩個時間點皮溫與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，且與對照組相比有較低的組織壞死率，其中VEGF基因轉染的EPCs組組織壞死率最低。VEGF基因轉染的EPCs組移植后有6例出現(xiàn)一過性肢體水腫。Brdu標記的細胞移植后，患肢腓腸肌冰凍切片免疫組化染色檢測到棕褐色細胞，證實移植細胞整合到了缺血局部。 結論1.用VEGF、bFGF、IGF-1誘導培養(yǎng)梯度離心法分離的骨髓單個核細胞，是誘導血管內皮祖細胞的一個簡便

12、可行的方法。其中VEGF是誘導的關鍵性因子，其濃度不應低于20ng/ml。 2.轉染比率(細胞：病毒)1∶50是EPCs轉染VEGF165基因的合適比率，過高的轉染比率會抑制EPCs的增殖，并造成細胞損傷。 3.VEGF165基因轉染后，對血管內皮祖細胞的增殖無明顯影響。 4.血管內皮祖細胞具有分泌VEGF的能力，而轉染VEGF165后的EPCs上清液中VEGF蛋白濃度明顯增加。 5.血管內皮祖細胞移植能