中藥紅景天對(duì)高糖條件下大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞及其生長因子作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]
　　 1.采用消化法體外培養(yǎng)出純度較高的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（MMVECs）備用。
　　 2.與培哚普利作對(duì)照，觀察紅景天含藥鼠血清對(duì)高糖條件下大鼠MMVECs的增殖活力、MMVECs上清液中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）分泌量和MMVECs內(nèi)VEGF基因表達(dá)水平的影響。
　　 [方法]
　　 新生5-7天Wistar大鼠，開胸心臟取材，用冷D-Hanks液反復(fù)沖洗3次，采用二次消化法（0.25

2、％胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶消化）分離、培養(yǎng)MMVECs，利用差速貼壁法和亞細(xì)胞克隆法純化MMVECs，用Ⅷ因子和CD31相關(guān)抗原進(jìn)行鑒定。
　　 取培養(yǎng)至第3代的MMVECs，在培養(yǎng)基中加入50mmol/L Glu、含50mmol/LGlu的紅景天（NDK）高、中、低劑量含藥血清和培哚普利（PD）含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)，72h時(shí)行MTT比色實(shí)驗(yàn)觀察MMVECs增殖活性的變化，透射電鏡下觀察MMVECs超微結(jié)構(gòu)的變化，并檢測(cè)MMVECs上清

3、液中VEGF的分泌量及MMVECs內(nèi)VEGF基因表達(dá)水平。
　　 [結(jié)果]
　　 1.成功培養(yǎng)出純度較高的MMVECs，可用于該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究。
　　 2.MTT比色實(shí)驗(yàn)：各組隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，OD值有所上升，72h時(shí)各糖濃度下的OD值比48h上升顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。72h時(shí)，與正常對(duì)照組比較，各濃度組OD值都有所降低，以50mmol/L和75mmol/L時(shí)OD值的降低最為顯著（P<0.01）

4、。用50mmol/LGlu培養(yǎng)72h時(shí)，NKD低組和PD組的OD值較50mmol/LGlu組顯著升高（均P<0.01），但兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 3.透射電鏡下觀察：高糖條件下MMVECs出現(xiàn)指狀突起，溶酶體增多，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。NDK低組含藥血清作用后能改善這種損傷，其作用與PD組相似。
　　 4.ELISA法檢測(cè)：高糖組、NDK高、中、低組和PD組MMVECs上清液中VEGF分

5、泌量較正常對(duì)照組均顯著降低（均P<0.01）；與高糖組相比，NDK中、低組和PD組MMVECs上清液中VEGF分泌量顯著升高（P<0.05，P<0.01）。NDK低組和PD組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 5.QT-PCR法檢測(cè)：高糖組、NDK高、中、低組及PD組MMVECs VEGF-mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著降低（P<0.01）。與高糖組相比，NDK低組MMVECsVEGF-mRNA表達(dá)增高，差異非常顯

6、著（P<0.01），PD組MMVECsVEGF-mRNA表達(dá)也增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。NDK低組與PD組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 [結(jié)論]
　　 1.采用二次消化法原代培養(yǎng)，經(jīng)差速貼壁法+亞細(xì)胞克隆法純化的新生Wistar大鼠MMVECs，經(jīng)Ⅷ因子和CD31相關(guān)抗原免疫熒光鑒定后，純度可達(dá)95％以上，可用于正式實(shí)驗(yàn)。
　　 2.高糖對(duì)MMVECs的增殖有抑制作用。NDK低劑

7、量組能促進(jìn)高糖條件下MMVECs的增殖，其作用與PD組相近似。
　　 3.透射電鏡下能觀察到高糖對(duì)MMVECs超微結(jié)構(gòu)的損傷，NDK低劑量組能改善這種損傷，其作用與PD組相似。
　　 4.高糖條件下，MMVECs上清液中VEGF分泌量及MMVECs內(nèi)VEGF基因表達(dá)水平顯著降低。NDK低劑量組可上調(diào)MMVECs上清液中VEGF的分泌量及MMVECs內(nèi)VEGF的基因表達(dá)水平，其作用優(yōu)于PD組。
　　 [創(chuàng)新點(diǎn)]