一個中國LHON大家系中新核修飾因子的發(fā)現(xiàn)與鑒定.pdf

1、LHON是一種常見的線粒體母系遺傳視神經(jīng)病變，主要累及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，臨床主要表現(xiàn)為雙眼同時或先后發(fā)生急性或亞急性的視力減退，同時伴有中心視野缺失和色覺障礙，病理改變顯現(xiàn)為視盤周圍神經(jīng)纖維層腫脹和毛細血管擴張。線粒體DNA的3個原發(fā)性突變(G11778A、G3460A、 T14484C)是LHON的主要分子發(fā)病基礎(chǔ)，卻不足以闡明LHON的不完全外顯、男性好發(fā)等特性，這表明LHON致病還受其它遺傳因素、環(huán)境因素的影響。不完全外顯和男性好

2、發(fā)是LHON的兩大特性，也是目前亟待解決的難題。
　　我們在研究中發(fā)現(xiàn)一個具有高外顯率(80％)、較低男女比率(1∶1.7) LHON家系（WZ162家系），研究發(fā)現(xiàn)mtDNA繼發(fā)突變及其他相關(guān)突變可能對此家系LHON發(fā)病無重要作用，我們推測可能存在核基因突變影響此家系LHON高外顯率。為尋找與此家系發(fā)病相關(guān)的核修飾基因，我們選擇此家系一名攜帶者Ⅱ-10，三名患者Ⅱ-1、Ⅲ-3、Ⅲ-6進行全基因組外顯子測序，并從33例錯義突變、9

3、例插入缺失、4例剪切位點突變中篩選出一個核基因突變-PRICKLE3 c.157C＞T。此突變導(dǎo)致PRICKLE3蛋白第53位高度保守的精氨酸(R)變?yōu)樯彼?W)，只存在WZ162家系的患者中，女性患者為雜合突變，男性患者為純合突變，家系內(nèi)正常對照及攜帶者均不含此突變，符合X連鎖的顯性遺傳模式。此外，此突變在篩查436位正常對照和179位來自55個LHON家系的母系成員與105位散發(fā)患者中均不存在。再通過Sanger測序?qū)RICKL

4、E3基因的全外顯子區(qū)域進行驗證，發(fā)現(xiàn)除c.157C＞T外，9個外顯子區(qū)域均不含其他突變。
　　經(jīng)過定位分析，我們發(fā)現(xiàn)PRICKLE3蛋白部分位于線粒體內(nèi)，可能與線粒體功能關(guān)聯(lián)。同時它在多種細胞及腦、肝臟、腎臟、肺、胎盤、胰臟等器官廣泛表達。為闡明PRICKLE3 c.157 C＞T突變對線粒體功能的影響，我們構(gòu)建了來自家系患者、攜帶者及正常對照的永生化淋巴細胞系，并進行一系列與線粒體功能相關(guān)的生化檢測。
　　生化檢測結(jié)果如下

5、0(1)PRICKLE3蛋白表達檢測顯示粗提線粒體總蛋白中對照組、攜帶者組、患者組的相對表達量分別為0.90、0.82、0.91，細胞總蛋白中對照組、攜帶者組、患者組的相對表達量分別為1.11、1.26、1.15，三組相互比較無顯著差異(P＞0.05)。(2)線粒體呼吸鏈亞基蛋白表達檢測顯示患者組ATP6亞基的相對表達量顯著低于攜帶者組(P=0.01)和對照組(P=0.05)，分別降低了35％、44％;ND4、ND5、ND6、CYTB、

6、CO2亞基相對表達量三組間無顯著差異(P＞0.05)(3)細胞氧耗(OCR)實時測定發(fā)現(xiàn)患者組的基礎(chǔ)OCR、ATP產(chǎn)能相關(guān)OCR、最大呼吸OCR分別比對照組降低了52％、59％、52％(P＜0.01);同時與攜帶者相比，患者組ATP產(chǎn)能相關(guān)OCR值下降幅度增大了24％(P＜0.05)。(4)ATP檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比較，患者組氧化磷酸化ATP產(chǎn)量減少了63％(P＜0.01)，攜帶者組氧化磷酸化ATP產(chǎn)量減少了43％(P=0.05)，患

7、者組氧化磷酸化ATP產(chǎn)量的下降幅度增大了20％(P＜0.01)，與患者組ATP6亞基的表達量降低及ATP產(chǎn)能相關(guān)OCR值下降幅度增大的結(jié)果一致。(5)膜電位檢測顯示攜帶者組和患者組線粒體膜電位低于對照組，差異顯著(P＜0.05)，但患者組與攜帶者組相比較，膜電位相似，無顯著差異(P＞0.05)。(6)在H2O2刺激下，對照組、攜帶者組、患者組的ROS水平的平均值分別為1.68、2.12、2.55，患者組、攜帶者組ROS水平提高幅度均顯著