減味壽胎丸對SA病證結合模型小鼠安胎機理的研究.pdf

1、目的:
　　為研究減味壽胎丸的安胎機理，用減味壽胎丸高劑量、中劑量、低劑量（以下簡稱高劑量組、中劑量組、低劑量組）、陽性對照藥環(huán)孢素(CsA)四種藥物干預自然流產(SA)病證結合模型小鼠，通過酶聯(lián)免疫吸附技術(ELISA)檢測血清白介素(IL-17)、蘇木精-伊紅染色法(HE)觀察各組小鼠蛻膜、胚胎、卵巢的形態(tài)學變化，實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應法(RT-qPCR)、免疫組化法(IHC)、蛋白印跡法(WB)檢測各組孕小鼠蛻膜組織

2、中IL-17、叉頭/翼狀螺旋轉錄因子3(Foxp3)、維甲酸孤核受體（RORγt）、孕激素受體PR基因與蛋白的表達差異，進而找出減味壽胎丸在本模型中發(fā)揮安胎機制的作用靶點，并探討減味壽胎丸與CsA是否能逆轉SA病證結合模型小鼠存在的Th17細胞/調節(jié)性T細胞(Th17/Treg)平衡偏移。
　　方法:
　　1.觀察各組孕小鼠實驗過程中的一般情況、造模及藥物干預前后的體重變化、胚胎吸收率，ELISA法檢測各組孕小鼠血清IL-1

3、7含量的差異。
　　2.RT-qPCR檢測各組孕小鼠妊娠子宮蛻膜組織中IL-17 mRNA、Foxp3 mRNA、RORγ tmRNA、PR mRNA的表達差異;HE染色法觀察各組孕小鼠蛻膜、胚胎及卵巢中卵泡與黃體的形態(tài)學差異，IHC與WB檢測各組孕小鼠IL-17、Foxp3、PR、RORγt蛋白表達的差異。
　　結果:
　　1.造模成功的標準:腎虛的評價:見小鼠畏寒喜暖、蜷縮拱背、體毛枯疏、失去光澤、精神萎頓、倦怠嗜

4、睡，自主活動次數(shù)明顯減少、行動困難，瞇眼、呼吸短促，躁動、易驚;進食量和飲水量下降，大便稀溏（肛門會粘有稀溏臭穢的大便）、小便清長;尾巴發(fā)涼，體溫下降、反應遲鈍，體重增長減慢甚至下降，開口變小，消化道澀滯，灌胃困難，有食物反流于口中。部分小鼠出現(xiàn)妊娠期間陰道流血甚至胚胎的排出，符合小鼠腎虛的生理病理表現(xiàn)，提示造模成功。空白組及減味壽胎丸高、中、低劑量組和陽性對照組的小鼠一般狀態(tài)良好，體毛順滑有光澤，精神狀態(tài)良好，活動自如，進食、進水量正

5、常，體重增加，組間差異不大。
　　2.妊娠第0天、第4.5天、第9天，各組孕小鼠體重無組間差異。妊娠第0天與妊娠第4.5天各組孕小鼠體重有組內差異;妊娠第4.5天與妊娠第9天各組孕小鼠體重有組內差異。
　　3.各組小鼠胚胎吸收率:模型1組、模型2組與空白組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.0016），高劑量組與模型1組相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.0016）;中劑量組、低劑量組、陽性對照組與模型1組相比較，差異具有統(tǒng)計

6、學意義（P＜0.0016）;中劑量組、低劑量組、陽性對照組組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.0016）。
　　4.模型1組、模型2組與空白組的孕小鼠血清IL-17水平有顯著差異（P＜0.01）;模型2組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性藥組與模型1組的孕小鼠血清IL-17水平有顯著差異（P＜0.01）;高劑量組與中劑量組、低劑量組、陽性對照組相比較，差異具有顯著性(P＜0.01);中劑量組與低劑量組相比較，差異具有統(tǒng)計學意

7、義(P＜0.05);中劑量與陽性對照組相比較，差異具有顯著性（P＜0.01）;低劑量組與陽性對照組相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　5.RT-qPCR結果顯示:小鼠蛻膜組織中Foxp3 mRNA、PR mRNA的表達，模型1組、模型2組較空白組明顯下調，藥物干預的四個組較模型1組的表達明顯上調;IL-17 mRNA、RORγt mRNA模型1組、模型2組較空白組明顯上調，藥物干預的四個組較模型1組的表達明顯下調;以上

8、藥物四個組組間上述四個基因的表達未見明顯趨勢性差異。
　　6.免疫組化結果顯示:小鼠蛻膜組織中Foxp3、PR蛋白的表達，模型1組、模型2組較空白組明顯下調，藥物干預的四個組較模型1組的表達明顯上調;IL-17、RORγt蛋白模型1組、模型2組較空白組明顯上調，藥物干預的四個組較模型1組的表達明顯下調。Foxp3、IL-17蛋白的表達，藥物干預的四個組組間未見明顯趨勢性差異。中藥3個劑量組對PR、RORγ t蛋白表達的調節(jié)效能均優(yōu)

9、于陽性對照組，但中藥3個劑量組之間未見明顯趨勢性差異。
　　7.蛋白印跡法結果顯示:小鼠蛻膜組織中Foxp3、PR蛋白的表達，模型1組、模型2組較空白組明顯下調，藥物干預的四個組較模型1組的表達明顯上調;IL-17、RORγt蛋白的表達，模型1組、模型2組較空白組明顯上調，藥物干預的四個組較模型1組的表達明顯下調。PR蛋白的表達，藥物干預的四個組組間未見趨勢性顯著差異，表明中藥3個劑量組與陽性對照組對該蛋白的調節(jié)效能相似。中藥3個

10、劑量組對Foxp3、RORγt蛋白表達的調節(jié)效能均優(yōu)于陽性對照組，且中藥3個劑量組對二者的調節(jié)效能呈趨勢性差異，其從高到低排序為:中劑量組＞低劑量組＞高劑量組。中藥3個劑量組對IL-17蛋白表達的調節(jié)效能均優(yōu)于陽性對照組，且中藥3個劑量組對二者的調節(jié)效能呈趨勢性差異，其從高到低排序為:低劑量組＞中劑量組＞高劑量組。
　　結論:
　　1.本實驗應用羥基脲建立SA小鼠CBA/J×DBA/2病證結合模型，初步得到該模型建立的標準化

11、流程。模型組小鼠妊娠子宮蛻膜組織中存在Foxp3、PR基因與蛋白的低表達，而IL-17、RORγt基因與蛋白的優(yōu)勢性表達。
　　2.減味壽胎丸不同劑量組可以不同程度的上調Foxp3基因與蛋白的表達;下調IL-17、RORγt基因與蛋白的表達;上調PR基因與蛋白的表達。
　　3.根據(jù)小鼠胚胎吸收率推論:Foxp3、IL-17、PR、RORγt基因與蛋白可能為減味壽胎丸與CsA在本病證結合SA小鼠模型中發(fā)揮安胎機制的作用靶點。<

12、br>　　本研究提示:IL-17為Th17高特異性分泌，RORγt為Th17特異性轉錄分子，此二者的高表達代表Th17細胞因子的高表達及其優(yōu)勢性地位;Foxp3為Treg的特異性轉錄分子，F(xiàn)oxp3的高表達代表Treg細胞因子的高表達及其優(yōu)勢性地位，結合上述實驗結果可知，在病證結合模型中，Th17細胞因子優(yōu)勢性表達;藥物干預后這一優(yōu)勢性表達發(fā)生逆轉，呈現(xiàn)Treg細胞因子的優(yōu)勢性表達，可見藥物干預使病證結合模型組Th17細胞因子優(yōu)勢性表達