補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)RSA小鼠母胎界面血管重鑄的干預(yù)機(jī)制研究.pdf

1、目的
　　本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上，以VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路為切入點(diǎn)，研究補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)RSA模型小鼠胎盤血管重鑄的干預(yù)機(jī)制。通過(guò)觀察蛻膜 VEGF、VEGFR-2、sVEGFR-1、MAPK、HIF-1α、ES、RAS和MVD的表達(dá)及組織形態(tài)學(xué)的變化，檢測(cè)VEGF、VEGF受體、促血管生成因子、抑血管生成因子、PI3K、AKT、p-AKT等mRNA的表達(dá)，探索補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路的影響，

2、揭示補(bǔ)腎健脾中藥促進(jìn)母胎界面血管重鑄、保護(hù)妊娠的分子生物學(xué)機(jī)制，以豐富補(bǔ)腎健脾中藥治療RSA的科學(xué)內(nèi)涵。
　　方法
　　通過(guò)文獻(xiàn)研究，總結(jié)分析RSA小鼠母胎界面血管生成與脾腎的關(guān)系；從中醫(yī)理論角度，闡釋RSA小鼠子宮蛻膜組織血管生成“從脾腎論治”的機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)取雌性CBA/J小鼠50只，雄性DBA/2小鼠20只，雄性BALB/c小鼠5只，按2∶1比例合籠交配，檢出陰栓者計(jì)為妊娠第0天，分別建立RSA模型CBA/J×

3、DBA/2小鼠與正常妊娠模型CBA×BALB/c小鼠，按妊娠順序隨機(jī)分為正常組、模型組和黃體酮膠囊對(duì)照組、補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組和補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組，每組動(dòng)物數(shù)均為8只。其中正常妊娠組、模型對(duì)照組分別予以蒸餾水灌胃，黃體酮膠囊組、補(bǔ)腎安胎沖劑低、高劑量組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)15天，末次給藥24h后，斷頸處死孕鼠，剖視子宮觀察各組小鼠胚胎丟失率，取其子宮蛻膜組織，病理形態(tài)學(xué)觀察子宮蛻膜組織變化，免疫組化 SP法檢測(cè)蛻膜組織 VEGF

4、、VEGFR-2、sVEGFR-1、MAPK、HIF-1α、ES、RAS和MVD的表達(dá)，蛋白免疫印跡技術(shù)（Western Blotting）檢測(cè)蛻膜組織MVD、HIF-1α、VEGF、ES及PI3K、AKT、p-AKT的表達(dá)，Q-PCR法檢測(cè)蛻膜組織VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA、sVEGFR-1 mRNA、Ras mRNA、MAPK mRNA、HIF-1αmRNA、ESmRNA的含量等。
　　結(jié)果
　　理論研

5、究結(jié)果：
　　1.母胎界面血管重鑄是維持妊娠的關(guān)鍵。胎兒及胎盤的正常發(fā)育都主要取決于滋養(yǎng)細(xì)胞的分化和子宮－胎盤血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。受精卵在著床過(guò)程之中，滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜和螺旋動(dòng)脈，前者產(chǎn)生大量血管生成因子，后者逐漸取代內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致螺旋動(dòng)脈擴(kuò)張，不僅使植入部位的血流增加，而且使子宮內(nèi)膜在短時(shí)間內(nèi)迅速蛻膜化，在各種血管生長(zhǎng)因子的共同調(diào)控下形成大量新生血管。
　　2.血管新生是促進(jìn)母胎界面血管重鑄的本質(zhì)。正常組織中由于缺少促血管

6、生成刺激因子或者血管生成刺激因子被高水平血管生成抑制因子嚴(yán)格控制，促血管生成和抑制血管生成兩者處于平衡狀態(tài)；當(dāng)促血管生長(zhǎng)因子濃度上升，或者血管生成抑制因子濃度下降，都會(huì)打破血管生成的調(diào)節(jié)平衡，促血管生成因素處于優(yōu)勢(shì)從而引起血管生成過(guò)程。
　　3.VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)促進(jìn)母胎界面血管重鑄。PI3K/AKT信號(hào)通路活化能通過(guò)多種途徑上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)，從而啟動(dòng)VEGF基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)VEGF表達(dá)。
　　

7、4.脾腎虧虛是 RSA的重要病機(jī)。妊娠從著床到胎盤形成的整個(gè)過(guò)程不僅需要豐富的血液供應(yīng)，而且都離不開血管新生、通透性改變，胚胎生長(zhǎng)發(fā)育、妊娠成功的關(guān)鍵在于胎兒、胎盤及子宮蛻膜血管的生長(zhǎng)發(fā)育，這就要求胎盤血管網(wǎng)需要充分發(fā)育才能滿足母胎之間氣體和養(yǎng)料的交換及胎兒代謝廢物的排泄的需要。這些都與中醫(yī)學(xué)“脾主運(yùn)化”、“脾主升清”、“腎藏精，主生殖”等理論密切關(guān)聯(lián)。
　　5.健脾益腎是促進(jìn) RSA母胎界面血管重鑄的重要治則。補(bǔ)腎健脾法具有防治

8、流產(chǎn)的確切療效，補(bǔ)腎健脾中藥補(bǔ)腎安胎沖劑能夠促進(jìn)血管的生成和發(fā)育，以維持正常的妊娠，為中藥通過(guò)改善蛻膜血管生成方面而發(fā)揮其保胎作用機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果：
　　1.與正常妊娠小鼠相比，模型組 RSA小鼠胚胎丟失率顯著升高并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、陽(yáng)性藥組RSA小鼠胚胎丟失率顯著降低并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　2.與正常妊娠小鼠比較，模型組RSA小鼠絨

9、毛形態(tài)呈現(xiàn)為大小不一，不規(guī)則狀，合體滋養(yǎng)層細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞也相對(duì)減少；模型組小鼠細(xì)胞可見萎縮變性，排列較為紊亂，并能觀察到明顯的凋亡細(xì)胞和炎性細(xì)胞；細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮態(tài)，染色程度較深；間充質(zhì)及基質(zhì)纖維素樣變性十分明顯，間質(zhì)血管也明顯減少；此外，蛻膜組織變性明顯，上皮有缺失，細(xì)胞排列凌亂，腺體呈皺縮狀，血管可見明顯瘀血。給予補(bǔ)腎安胎沖劑和黃體酮膠囊干預(yù)后，RSA小鼠蛻膜組織血管形態(tài)學(xué)呈現(xiàn)好轉(zhuǎn)趨勢(shì)。
　　3.在各組小鼠蛻膜組織

10、中，VEGF的表達(dá)主要見于蛻膜細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中，細(xì)胞核著色不明顯，蛻膜細(xì)胞陽(yáng)性染色強(qiáng)；VEGFR-2在蛻膜組織的陽(yáng)性表達(dá)位于大部分蛻膜細(xì)胞及少數(shù)腺上皮細(xì)胞的胞核和胞漿內(nèi)；sVEGFR-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在豐富的表達(dá)。模型組RSA小鼠VEGF、VEGFR-2的表達(dá)低于正常組、低劑量組、高劑量組及陽(yáng)性藥組；sVEGFR-1的表達(dá)高于正常組、低劑量組、高劑量組及陽(yáng)性藥組。
　　4.與正常組相比，模型組RSA小鼠HI

11、F-1α、VEGF、MVD蛋白表達(dá)顯著降低、ES蛋白顯著升高并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組HIF-1α、VEGF、MVD3種蛋的白表達(dá)升高、而ES蛋白則降低，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　5.與正常組比較，模型組PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)顯著升高并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

12、義（P＜0.05）。
　　6.與正常組相比，模型組RSA小鼠HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)顯著降低、ES mRNA顯著升高并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)顯著升高、ES mRNA顯著降低并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　7.與正常組相比，模型組RSA小鼠RAS、MAPK、VEGF-R2 mRNA表達(dá)顯著降低、SVEGF-R1 mRN

13、A顯著升高并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組Ras、MAPK、VEGF-R2 mRNA表達(dá)顯著升高、SVEGF-R1 mRNA顯著降低并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論
　　RSA小鼠存在蛻膜血管新生障礙，且蛻膜血管新生與VEGF/PI3K/AKT表達(dá)有關(guān)。補(bǔ)腎安胎沖劑能明顯改善RSA小鼠胚胎丟失率、促進(jìn)蛻膜血管新生。補(bǔ)腎安胎沖劑改善RSA小鼠蛻膜血管新生的機(jī)制在于：

14、r>　　1.補(bǔ)腎安胎沖劑通過(guò)調(diào)節(jié)蛻膜組織細(xì)胞因子表達(dá)改善 RSA小鼠血管新生：通過(guò)上調(diào)蛻膜血管VEGF、VEGFR-2、MAPK、HIF-1α、RAS和MVD蛋白表達(dá)，下調(diào)sVEGFR-1和ES蛋白表達(dá)，從而改善RSA小鼠蛻膜血管新生。
　　2.補(bǔ)腎安胎沖劑通過(guò)調(diào)節(jié)蛻膜組織 VEGF/PI3K/AKT通路表達(dá)改善RSA小鼠蛻膜血管新生：通過(guò)上調(diào)蛻膜血管PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)VEGF/PI3K/AKT通路表達(dá)，改

15、善RSA小鼠胚胎丟失率和蛻膜血管新生。
　　3.補(bǔ)腎安胎沖劑通過(guò)調(diào)節(jié)蛻膜組織HIF-1α、VEGF、ES mRNA水平改善RSA小鼠蛻膜血管新生：通過(guò)上調(diào)蛻膜血管HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)，下調(diào)ES mRNA水平，改善RSA小鼠胚胎丟失率和蛻膜血管新生。
　　4.補(bǔ)腎安胎沖劑通過(guò)調(diào)節(jié)蛻膜組織RAS、MAPK、VEGF-R2 mRNA、SVEGF-R1 mRNA水平改善RSA小鼠蛻膜血管新生：通過(guò)上調(diào)蛻膜血管Ras、