無機(jī)砷對(duì)大鼠HSC纖維化改變及DNMTs表達(dá)的實(shí)驗(yàn)觀察.pdf

1、目的：研究不同劑量無機(jī)砷刺激大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC)后其纖維化情況，觀察在此過程中DNMTs的變化，為進(jìn)一步闡述無機(jī)砷致肝損傷的作用機(jī)制提供依據(jù)。
　　方法：1.采用MTT還原法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞活力；確定LC50和染毒濃度即亞砷酸鈉(As3+)低、中、高劑量組和砷酸鈉(As5+)低、中、高劑量組。2.流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)不同劑量和時(shí)間點(diǎn)的大鼠HSC-T6的凋亡情況。3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked Imm

2、unosorbentAssays,ELISA)檢測(cè)無機(jī)砷干預(yù)大鼠HSC-T6后的Ⅰ型膠原(COL-1)、Ⅲ型膠原(COL-3)和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的含量。4.通過實(shí)時(shí)熒光定量(Real-Time Quantitative PCR)檢測(cè)無機(jī)砷干預(yù)大鼠HSC-T6后TGF-β1、DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3l的mRNA的表達(dá)水平。5.蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡試驗(yàn))即Western Blot檢測(cè)無機(jī)

3、砷干預(yù)大鼠HSC-T6后TGF-β1和DNMT3a在細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：1.無機(jī)砷染毒 HSC-T6細(xì)胞48h時(shí)，測(cè)得 As3+的LC50為60.00μmol/L，As5+的LC50為93.00μmol/L，即亞砷酸鈉組的低、中、高劑量依次是5μmol/L、15μmol/L、25μmol/L。砷酸鈉組的低、中、高劑量依次是20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L。對(duì)照組為0μmol/L。細(xì)胞的增殖活力隨劑量時(shí)

4、間升高而降低。2.在24h時(shí)，除五價(jià)砷低劑量組外其它染毒組的凋亡率都高于對(duì)照組(P﹤0.05)；48h和72h時(shí)隨著染砷濃度的增加，凋亡率逐漸升高(P﹤0.05)。濃度一定時(shí)，所有染砷組隨著染砷時(shí)間的增加凋亡率升高(P﹤0.05)。3.各染砷組的COL-1、COL-3、α-SMA的含量隨染砷時(shí)間和染砷劑量的增加而升高(P﹤0.05)。4.與對(duì)照組相比TGF-β1的mRNA表達(dá)水平隨染砷劑量的增加而上調(diào)(P﹤0.05)；相同濃度隨著染砷時(shí)

5、間的延長(zhǎng)，TGF-β1的mRNA表達(dá)水平也在不斷的增加(P﹤0.05)。5.在同一時(shí)間下，DNMT1的mRNA表達(dá)量隨染砷濃度的升高而上調(diào)(P﹤0.05)；同一濃度下，DNMT1mRNA的表達(dá)量隨染砷時(shí)間遞增而下調(diào)(P﹤0.05)。6.同一時(shí)間下，隨三價(jià)砷染毒劑量的升高DNMT2mRNA的表達(dá)水平呈現(xiàn)為上調(diào)(P﹤0.05)，而五價(jià)砷染毒劑量的升高DNMT2mRNA的表達(dá)水平呈現(xiàn)為下調(diào)(P﹤0.05)。同一濃度下，在48h時(shí)三價(jià)中、高劑量

6、組與五價(jià)低、高劑量組DNMT2mRNA的表達(dá)水平為上調(diào)(P﹤0.05)。7.DNMT3a的mRNA的表達(dá)量隨染砷劑量的升高在降低(P﹤0.05)，但仍是上調(diào)；同一劑量組下，隨染毒時(shí)間的延長(zhǎng)DNMT3a的mRNA表達(dá)水平為上調(diào)(P﹤0.05)。8.同一時(shí)間下，24h時(shí)三價(jià)砷低劑量組DNMT3b的mRNA是表達(dá)上調(diào)(P﹤0.05)，其它組都是表達(dá)下調(diào)(P﹤0.05)；48h時(shí)DNMT3b的mRNA在三價(jià)砷中劑量組表達(dá)下調(diào)，但在三價(jià)砷高劑量組

7、及五價(jià)砷低、高劑量組表達(dá)上調(diào)(P﹤0.05)。濃度一定的情況下，48h、72h時(shí)DNMT3b的mRNA的表達(dá)在三價(jià)砷中劑量與五價(jià)砷中劑量為下調(diào)(P﹤0.05)，其余為上調(diào)(P﹤0.05)。9.24h時(shí)三價(jià)砷高劑量組，五價(jià)砷中、高劑量組DNMT3l的mRNA表達(dá)為上調(diào)(P﹤0.05)，48h時(shí)三價(jià)砷中、高劑量組DNMT3l的mRNA表達(dá)為上調(diào)(P﹤0.05)。72h時(shí)三價(jià)砷中劑量組顯示為上調(diào)(P﹤0.05)。同一濃度下，在48h、72h時(shí)

8、的所有染砷組的DNMT3l的mRNA的表達(dá)水平除三價(jià)中劑量是上調(diào)，其它組是下調(diào)(P﹤0.05)。10.對(duì)無機(jī)砷誘導(dǎo) HSC-T6細(xì)胞72h時(shí)的各基因做相關(guān)分析，TGF-β1mRNA的表達(dá)與DNMT2mRNA的表達(dá)和DNMT3amRNA的表達(dá)呈高度正相關(guān)(P﹤0.01)。11.Western Blot檢測(cè)顯示TGF-β1和DNMT3a在細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)隨時(shí)間和濃度的增加而上升。且不同組間和不同時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。