KC和HSC間相互作用對肝纖維化的影響.pdf

1、肝纖維化是機(jī)體對慢性肝損害的損傷—愈合反應(yīng)，如果肝損害持續(xù)可導(dǎo)致肝硬化和肝功能衰竭。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)活化并引起大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，在抗肝纖維化的治療中，除了要盡量消除肝臟損害因素外，其關(guān)鍵是抑制HSC的活化、誘導(dǎo)活化HSC的凋亡并促進(jìn)ECM的降解。 肝枯否細(xì)胞(kupffer cells，KC

2、)是體內(nèi)數(shù)量最多的巨噬細(xì)胞，也是主要的炎癥效應(yīng)細(xì)胞，可啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致組織重塑和纖維化形成。肝纖維化時，KC活化并釋放炎癥介質(zhì)，如細(xì)胞因子、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和類花生酸類物質(zhì)，參與HSC的活化和肝纖維化的形成。KC是肝內(nèi)唯一表達(dá)5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LO)的竇周細(xì)胞，5-LO誘導(dǎo)產(chǎn)生的花生四烯酸產(chǎn)物在KC活化、增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 本研究旨在探討

3、肝纖維化時KC和HSC間的相互作用，以及5-LO在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用。我們通過原代培養(yǎng)KC和HSC，首先研究LPS誘導(dǎo)的活化KC與活化HSC間的相互作用，并觀察5-LO在其中的可能作用；然后觀察應(yīng)用AA-861抑制5-LO途徑對KC和ItSC的活化、增殖和基因表達(dá)的影響；最后，通過CCl<,4>注射法建立肝纖維化大鼠模型，觀察AA-861治療對肝纖維化的影響。本研究共分四部分。 第一部分大鼠肝星狀細(xì)胞和枯否細(xì)胞的同步分離和

4、培養(yǎng) 目的：體外同步分離和培養(yǎng)大鼠原代HSC和KC。 方法：采用Ⅳ型膠原酶肝臟灌注消化及Percoll密度梯度離心等方法體外同步分離、純化及培養(yǎng)HSC和KC，并以光學(xué)顯微鏡、免疫組化和電子顯微鏡等方法作鑒定。 結(jié)果：每只鼠肝的HSC和KC的細(xì)胞得率分別為2.3～2.8×10<’7>/肝和0.8～1.3×10<’7>／肝，平均純度分別為(94.3±2.5)％和(95.2±2.1)％，活力分別為(97.5±2.1)％

5、和(96.44±2.4)％。分別應(yīng)用免疫組化和光鏡、電鏡結(jié)果證實(shí)為HSC和KC。 結(jié)論：以本方法分離、純化和培養(yǎng)HSC和KC簡單、實(shí)用、便捷。 第二部分肝KC和HSC間的相互作用及5-LO在其中的作用 目的：探討HSC與KC間的相互作用以及5-LO在其中的可能作用。 方法：(1)觀察LPS激活KC后5-LO、FLAP和Caspase9等基因表達(dá)以及5-LO代謝產(chǎn)物含量的變化；(2)將上述活化KC上清液加入

6、靜止或活化HSC中，觀察HSC的活化、凋亡和基因表達(dá)變化；(3)觀察活化HSC上清液對活化KC凋亡和KC中5-LO、FLAP等基因表達(dá)的影響。 結(jié)果：(1)LPS激活的KC中5-LO、FLAP和Caspase9等基因表達(dá)增加，特別是Caspase9的表達(dá)顯著增加，同時5-LO代謝產(chǎn)物含量也顯著增加；(2)LPS誘導(dǎo)的活化KC上清液加入靜止HSC可提高其增殖力并增加Collagen-1、α-SMA和TIMP-1等基因的表達(dá)；活化H

7、SC加入8±16h組活化KC上清液(KC先用LPS培養(yǎng)8h后換液，然后用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)16h)后，活化HSC凋亡顯著增加。(3)活化HSC上清液對活化KC的凋亡和基因表達(dá)無明顯影響。 結(jié)論：LPS可激活并增加KC中5-LO、FLAP和Caspase9等基因的表達(dá)，其中5-LO的代謝產(chǎn)物L(fēng)TB<,4>、Cys-LTS等可參與HSC的早期活化，而Caspase9可誘導(dǎo)活化HSC的凋亡而抑制ECM的合成。 第三部分AA-861

8、抑制5-LO途徑對KC和HSC的影響 目的：探討AA一861特異性抑制5-LO途徑對KC的凋亡和基因表達(dá)的影響。 方法：(1)觀察AA一861對LPS誘導(dǎo)的活化KC中5-LO mRNA和蛋白的表達(dá)，以及對KC凋亡的影響；(2)將LPS和AA一861處理后的KC上清液加入靜止HSC中，觀察HSC的活化、增殖情況，以及α-SMA、Collagen-1、MMP一2、TIMP一1等基因的表達(dá)情況。 結(jié)果：(1)經(jīng)LPS

9、刺激后，KC中5-LO的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加，同時5-LO代謝產(chǎn)物L(fēng)TB<,4>和Cys-LTs的含量也顯著增加；AA一861顯著降低LPS誘導(dǎo)的活化KC中5-LO mRNA和蛋白的表達(dá)，同時降低了細(xì)胞培養(yǎng)上清中5-LO代謝產(chǎn)物的含量，但AA一861對正常靜止?fàn)顟B(tài)的KC的凋亡和基因表達(dá)無明顯影響；(2)LPS誘導(dǎo)的活化KC上清液加入靜止HSC后，HSC的增殖力顯著增加，同時HSC中Collagen一1、α-SMA和TIMP一1等

10、基因的表達(dá)也顯著提高，加用AA-861的活化KC上清液可抑制靜止HSC的活化，降低其增殖力和各基因的表達(dá)。 結(jié)論：AA一861可通過抑制5-LO途徑，誘導(dǎo)過度增殖的KC凋亡，從而抑制HSC的活化、增殖和ECM的合成。 第四部分 AA-861治療對肝纖維化發(fā)展的影響 目的：探討5-L0特異性抑制劑AA-861治療對大鼠肝纖維化的影響。 方法：在CCl<,4>誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，在注射CCl<,4>的前

11、二天開始腹腔內(nèi)注射AA-861(0.2 mg/100g，1次/天)，直到CCl<,4>注射的第2、4、6周處死大鼠，摘取肝臟并提取血清，應(yīng)用實(shí)時定量PCR檢測肝臟中5-LO、Collagen-1、α-SMA和TIMP-1等基因的表達(dá)，檢測肝功能和肝臟組織中羥脯氨酸(Hyp)的含量，同時取大鼠肝臟行組織學(xué)檢查，并對肝纖維化程度進(jìn)行分級評分。 結(jié)果：隨著肝纖維化程度的加重，肝組織中5-LO、FLAP、Collagenl-1和TIM

12、P-1等基因的表達(dá)顯著增加，同時肝功能ALT、BSA等指標(biāo)顯著升高；應(yīng)用AA-861后可顯著降低上述各基因的表達(dá)，尤其是5-L0、Collagen-1、α-SMA和TIMP-1等的表達(dá)顯著降低，同時Hyp、肝功能和肝纖維化程度評分也顯著降低。 結(jié)論：AA-861可通過抑制5-L0途徑，誘導(dǎo)過度增殖的KC凋亡，從而抑制HSC的活化并降低HSC中Collagen-1、α-SMA和TIMP-1等基因的表達(dá)，改善肝功能并減輕肝纖維化程度