基于超高速離心濃縮技術(shù)的HBV低載量樣本檢測(cè)體系的初步研究.pdf

1、目的:
　　乙肝病毒是我國(guó)主要的輸血傳播病原體之一。雖然目前在全國(guó)統(tǒng)一開(kāi)展了核酸檢測(cè)措施，但仍然存在一定的殘余風(fēng)險(xiǎn)。主要因?yàn)椴糠肢I(xiàn)血者體內(nèi)病毒載量極低，低于常用的多人份混樣檢測(cè)試劑的靈敏度，加之目前大部分進(jìn)口試劑的設(shè)計(jì)不太適合國(guó)內(nèi)的病毒流行株。針對(duì)目前出現(xiàn)的問(wèn)題，本文主要目的是初步研究適合中國(guó)流行特征的HBV低載量樣本的篩查/定量檢測(cè)體系。
　　方法:
　　1、選定磁珠法提取體系的成分，通過(guò)正交設(shè)計(jì)表初步確定其濃度或酸

2、堿度，主要包括GuSCN、蛋白酶K、異丙醇及PH;固定其它因素，優(yōu)化單一成分濃度，最終確定提取體系各成分濃度;選擇4種廠家的硅基磁珠，比較不同磁珠的提取效果;確定磁珠種類后，優(yōu)化磁珠用量。確定提取體系后與成品化提取試劑盒(包括QIAamp(@) DNA Blood Mini Kit及MagPure Viral DNA/RNA Mini KF Kit)進(jìn)行比較。
　　2、在NCBI的Nucleotide中輸入HBV、China、co

3、mplete genome等關(guān)鍵詞找到中國(guó)地區(qū)的HBV序列，經(jīng)比對(duì)后在保守序列設(shè)計(jì)引物探針，引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)PMD-19載體連接制備成質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并測(cè)序驗(yàn)證序列，計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)，并稀釋成不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)買(mǎi)第三方標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正，繪制HBV標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用Probit分析計(jì)算檢測(cè)下限，驗(yàn)證靈敏度、特異性等。將建立好的HBV熒光定量檢測(cè)方法檢測(cè)100例樣本，并與羅氏cobas(@)TaqScreenMPX Test，ve

4、rsion2.0檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　3、用HBV陰性血漿稀釋HBV標(biāo)準(zhǔn)品，制成低拷貝樣本;固定離心時(shí)間，研究不同離心力與病毒回收率的關(guān)系;固定離心力，研究離心時(shí)間對(duì)回收率的影響;最后使用低載量樣本對(duì)超高速濃縮技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證并評(píng)估其應(yīng)用價(jià)值。
　　結(jié)果:
　　1、提取體系的優(yōu)化結(jié)果:GuSCN濃度2.0M，蛋白酶K濃度為0.89mg/ml，異丙醇35％，PH為8;磁珠的選擇:A磁珠;磁珠用量:30ul。

5、建立的磁珠提取系統(tǒng)在高、中、低三個(gè)濃度的提取效率與兩種試劑盒比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、建立的HBV檢測(cè)體系引物探針特異性好，質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果完全吻合，標(biāo)準(zhǔn)品曲線R2＞0.999，擴(kuò)增效率為92.75％，線性范圍為5.0×101-2.5×109IU/mL，95％檢測(cè)下限為16.2IU/mL，批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)為0.15％-1.11％，批間變異系數(shù)為0.91％-4.67％。與羅氏檢測(cè)結(jié)果相關(guān)關(guān)系為y=0.916x+2.186，(R=0.

6、96; P＜0.001)。
　　3、當(dāng)離心力在15000g-90800g時(shí)，HBV病毒回收率從41.43％增加至88.29％;當(dāng)離心力在為90800g-138900g時(shí)，HBV病毒回收率相對(duì)穩(wěn)定在80％-90％之間;當(dāng)離心力在138900g-171000g時(shí)，HBV病毒回收率從88.29％下降至62.94％。離心時(shí)間為0.5h、1h、1.5h及2h時(shí)，其回收分別為88.31％、89.70％、88.40％、75.62％。運(yùn)用濃縮技術(shù)

7、后，發(fā)現(xiàn)8例cobas(@)TaqScreen MPX Test，version2.0漏檢樣本。
　　4、將超高速離心濃縮技術(shù)與本實(shí)驗(yàn)建立的HBV檢測(cè)體系結(jié)合時(shí)，單個(gè)樣本取樣量不少于2ml時(shí)（N人份混檢時(shí)，每個(gè)樣本取2ml混合，共N*2ml），離心濃縮后靈敏度可達(dá)2IU/mL;單個(gè)樣本取樣量不少于4ml時(shí)（N人份混檢時(shí)，每個(gè)樣本取4ml混合，共N*4ml），靈敏度可達(dá)1IU/mL。
　　結(jié)論:
　　1、通過(guò)優(yōu)化提取試劑