NSTK對(duì)AD動(dòng)物模型的神經(jīng)保護(hù)作用及調(diào)控能量代謝障礙的機(jī)制.pdf

1、阿爾茨海默疾?。ˋlzheimer’s disease，AD）是由多種因素誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD的病理機(jī)制復(fù)雜，對(duì)擬用于AD治療候選藥物的科學(xué)評(píng)價(jià)需采用能較準(zhǔn)確模擬AD病理特征的模型，特別是相應(yīng)的整體動(dòng)物模型。AD的早期病理進(jìn)程之一為能量代謝障礙，能量代謝障礙的發(fā)生和發(fā)展直接影響AD的其他病理進(jìn)程包括炎癥及氧化應(yīng)激等，因此針對(duì)能量代謝障礙的干預(yù)手段可有效提高AD的療效。
　　在前期神經(jīng)保護(hù)藥物的研究中，我們聚焦具有自主

2、知識(shí)產(chǎn)權(quán)的內(nèi)源性大麻素（anandamide，AEA）類(lèi)似物脂肪酰氨基酸。通過(guò)系統(tǒng)研究，我們發(fā)現(xiàn)了水溶性強(qiáng)、穩(wěn)定及成藥性好的抗腦缺血的神經(jīng)保護(hù)候選藥─N-硬脂酰酪氨酸二鉀鹽（Dipotassium N-stearoyltyrosinate，NSTK）。在對(duì)NSTK成藥性的系統(tǒng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)NSTK作為脂肪酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH）抑制劑，通過(guò)作用于大麻素系統(tǒng)（endocannabino

3、id system，ECS）干預(yù)腦缺血過(guò)程的多條損傷途徑，達(dá)到其神經(jīng)保護(hù)作用。由于對(duì)腦缺血損傷和AD損傷的干預(yù)有一定的相似性，我們?cè)诩?xì)胞水平對(duì) NSTK抗 AD的活性及其機(jī)制進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗AD導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、興奮毒性等作用。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)NSTK治療AD的可行性及探討其機(jī)制，本文在AD動(dòng)物模型上考察NSTK的神經(jīng)保護(hù)作用，研究其通過(guò)干預(yù)炎癥、氧化應(yīng)激、糖代謝障礙等多個(gè)病理進(jìn)程發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制；我們還通過(guò)U251細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

4、探討NSTK通過(guò)干預(yù)能量代謝障礙影響炎癥及氧化應(yīng)激等病理進(jìn)程的作用及其機(jī)制。
　　第一章 NSTK對(duì)AD動(dòng)物模型的神經(jīng)保護(hù)作用
　　本章選擇APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠以及Tau單轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)動(dòng)物行為學(xué)，組織病理學(xué)，ELISA實(shí)驗(yàn)等，評(píng)價(jià)NSTK在轉(zhuǎn)基因AD動(dòng)物模型上的神經(jīng)保護(hù)活性。我們觀察到NSTK（30 mg/kg，45 mg/kg）明顯改善APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠和Tau單轉(zhuǎn)基因小鼠的整體行為能力。

5、行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，NSTK可劑量依賴性地改善轉(zhuǎn)基因小鼠的自主活動(dòng)，焦慮行為及提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。由于同Tau單轉(zhuǎn)基因小鼠相比APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠的行為學(xué)以及病理特征更加明顯，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，AD動(dòng)物模型均采用APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠。我們觀察了NSTK對(duì)APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)保護(hù)活性，采用免疫熒光和ELISA方法，觀察到NSTK顯著降低皮層和海馬區(qū)Aβ斑塊以及Aβ42和Aβ40的含量，降低NFTs的產(chǎn)

6、生，提高皮層和CA1區(qū)神經(jīng)元的存活率，抑制皮層和DG區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。結(jié)果表明，NSTK在AD動(dòng)物模型上表現(xiàn)出較好的神經(jīng)保護(hù)活性，該活性可能涉及協(xié)同干預(yù)多個(gè)病理進(jìn)程。以上研究結(jié)果為具有良好成藥性的抗腦缺血神經(jīng)保護(hù)候選藥NSTK應(yīng)用于AD治療提供了積極的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　第二章 NSTK對(duì)APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因小鼠多損傷途徑干預(yù)的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制
　　AD的病理機(jī)制涉及炎癥、氧化應(yīng)激、糖代謝障礙等多條損傷途徑，僅干預(yù)單

7、一的病理進(jìn)程對(duì)AD的防治療效有限，協(xié)同干預(yù)多條損傷途徑可有效提高AD療效。我們通過(guò)Elisa和Western blotting實(shí)驗(yàn)，觀察了NSTK對(duì)APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬組織中與炎癥、氧化應(yīng)激、糖代謝障礙等病理進(jìn)程中相關(guān)細(xì)胞因子及蛋白表達(dá)的影響。NSTK（30 mg/kg，45 mg/kg）處理APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因小鼠可明顯降低海馬組織中炎性因子（IL-1β，TNF-α）的含量及下調(diào)與炎癥相關(guān)蛋白NF-κB的表達(dá)

8、；降低海馬組織中脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的含量，提高與氧化應(yīng)激水平相關(guān)酶CAT、SOD的活力；提高海馬組織中葡萄糖的含量及上調(diào)與葡萄糖代謝及調(diào)控葡萄糖代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)蛋白（GLUTs、p-AMPK）的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物水平進(jìn)一步證明，NSTK可通過(guò)抑制炎癥、氧化應(yīng)激、糖代謝障礙等多條損傷途徑起到較好的神經(jīng)保護(hù)作用。這些觀察不僅從機(jī)制上支撐了上一章得出的“NSTK對(duì)AD動(dòng)物模型具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用”的結(jié)論，也為下一章基于U251

9、細(xì)胞開(kāi)展的“NSTK對(duì)能量代謝障礙的調(diào)控作用及對(duì)炎癥、氧化應(yīng)激損傷修復(fù)的影響”的研究奠定整體動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第三章 NSTK調(diào)控U251細(xì)胞能量代謝障礙及其機(jī)制
　　能量代謝障礙是AD發(fā)生發(fā)展的早期事件，干預(yù)能量代謝障礙對(duì)AD發(fā)生發(fā)展中出現(xiàn)的炎癥和氧化應(yīng)激等病理進(jìn)程有重要的影響。調(diào)控能量代謝障礙并通過(guò)調(diào)控能量代謝障礙改善炎癥和氧化應(yīng)激等病理進(jìn)程有助于提高AD的療效。
　　能量代謝障礙的主要表現(xiàn)是葡萄糖攝取下降。本

10、章采用U251細(xì)胞建立模擬能量代謝障礙的低氧損傷模型，并進(jìn)一步評(píng)價(jià)了NSTK逆轉(zhuǎn)低氧引起的U251細(xì)胞中葡萄糖攝取下降的活性及機(jī)制。NSTK（1μmol/L–5μmol/L）處理48 h-96 h可時(shí)間、劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)了低氧引起的U251細(xì)胞葡萄糖攝取障礙。NSTK處理U251細(xì)胞48 h對(duì)低氧誘導(dǎo)的U251細(xì)胞的葡萄糖攝取障礙逆轉(zhuǎn)作用明顯，而對(duì)其IL-1β、TNF-α釋放的增加以及MDA生成的增加逆轉(zhuǎn)作用不明顯，NSTK處理72 h

11、和96 h均能逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)，表明NSTK逆轉(zhuǎn)葡萄糖攝取障礙的作用先于炎癥和氧化應(yīng)激的作用，提示NSTK逆轉(zhuǎn)葡萄糖攝取障礙可能進(jìn)一步影響其對(duì)細(xì)胞中 IL-1β、TNF-α釋放以及MDA生成增加的逆轉(zhuǎn)作用。低氧模型U251細(xì)胞中的葡萄糖攝取相關(guān)蛋白GLUTs表達(dá)明顯減少，而NSTK處理96 h能有效地逆轉(zhuǎn)上述GLUTs蛋白表達(dá)的減少，表明低氧導(dǎo)致 U251細(xì)胞的能量代謝障礙及NSTK對(duì)該過(guò)程的干預(yù)均與GLUTs蛋白表達(dá)的變化有關(guān)。AMPK抑

12、制劑可逆轉(zhuǎn)NSTK上調(diào)細(xì)胞中總GLUTs和細(xì)胞膜上GLUTs蛋白表達(dá)，而PI3K抑制劑不能逆轉(zhuǎn)此過(guò)程，表明NSTK調(diào)控GLUTs干預(yù)低氧損傷U251細(xì)胞能量代謝的機(jī)制可能通過(guò)AMPK介導(dǎo)的通路，而不依賴于PI3K通路所介導(dǎo)。進(jìn)一步，我們還發(fā)現(xiàn)AMPK抑制劑能逆轉(zhuǎn)NSTK對(duì)低氧損傷U251細(xì)胞葡萄糖攝取、炎癥及氧化應(yīng)激水平的作用，而PI3K抑制劑無(wú)此作用，表明AMPK通路可能參與NSTK調(diào)控葡萄糖攝取、炎癥和氧化應(yīng)激過(guò)程，而這些過(guò)程不依賴

13、于PI3K通路所介導(dǎo)。最后，通過(guò)觀察低氧損傷U251細(xì)胞應(yīng)用NSTK后及存在AMPK抑制劑等條件下p-AMPK的蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)NSTK可上調(diào)低氧損傷U251細(xì)胞中p-AMPK的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí) AMPK確實(shí)介導(dǎo)了 NSTK調(diào)控低氧損傷 U251細(xì)胞葡萄糖攝取、炎癥和氧化應(yīng)激過(guò)程。本章闡明了NSTK干預(yù)低氧損傷細(xì)胞中能量代謝障礙的作用，該作用對(duì)炎癥、氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)的影響，以及上述作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這些研究結(jié)果為NSTK應(yīng)用于A

14、D治療提供了理論支撐，也豐富了大麻素系統(tǒng)介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)藥物的作用機(jī)制理論研究。
　　本研究：
　?。?）基于動(dòng)物模型進(jìn)一步證實(shí)了NSTK對(duì)AD的神經(jīng)保護(hù)活性，其在整體動(dòng)物上的數(shù)據(jù)為治療AD提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提示NSTK作為治療AD的候選藥物具有進(jìn)一步的研發(fā)價(jià)值。
　　（2）闡釋了NSTK通過(guò)干預(yù)能量代謝障礙、炎癥和氧化應(yīng)激等多條損傷途徑，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制，這一結(jié)果豐富了NSTK作為神經(jīng)保護(hù)劑的理論依據(jù)。