SIRPα敲除對小鼠能量代謝的影響及機制的初步研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展以及人們飲食結(jié)構(gòu)的多元化，肥胖在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈現(xiàn)著逐年上升的趨勢。肥胖會引起2型糖尿病、腫瘤以及心腦血管疾病等，危害公共衛(wèi)生和人們的生命健康。心腦血管疾病以及腫瘤分別是現(xiàn)在造成人類死亡的第一以及第二位的重要因素。因而，對于肥胖的機制以及干預靶標的研究則顯得尤為緊迫以及重要，除此之外還有重要的社會經(jīng)濟價值。
　　脂肪組織不僅僅是機體存儲脂肪以及能量的器官，更是調(diào)節(jié)機體代謝以及能

2、量穩(wěn)態(tài)的重要器官，另有學者認為脂肪組織更是一種內(nèi)分泌器官。隨著對于肥胖機制研究的深入，肥胖發(fā)生的炎癥機制也逐漸被人們所認知，肥胖人群脂肪組織常常伴隨著慢性低度炎癥以及炎性細胞的浸潤。研究發(fā)現(xiàn)，生理狀態(tài)下的脂肪組織有少量的固有免疫細胞存在，并且通過分泌細胞因子招募單核巨噬細胞。基于以上的研究發(fā)現(xiàn)，我們也可以認為脂肪組織是免疫系統(tǒng)以及代謝系統(tǒng)的紐帶，為兩者之間的密切聯(lián)系提供基礎。
　　肥胖相關組織的炎癥反應會導致相關組織器官的胰島素敏

3、感性下降，組織器官胰島素抵抗的產(chǎn)生會進一步加重組織代謝穩(wěn)態(tài)的失衡。代謝穩(wěn)態(tài)與免疫穩(wěn)態(tài)息息相關，相互作用。許多的研究發(fā)現(xiàn)，胰島素信號通路在炎癥發(fā)生的時候會受到NF-κB信號通路的影響進而被顯著抑制。肥胖所致慢性炎癥反應相關的炎癥信號通路的活化主要出現(xiàn)在胰島素敏感的靶器官，例如脂肪組織、肝臟、骨骼肌;這也反映了炎癥對于系統(tǒng)性胰島素抵抗的發(fā)生有著至關重要的作用。
　　但是，具體的代謝如何影響免疫以及免疫又如何影響代謝的機制仍不是很清楚。

4、本研究利用Talen基因敲除技術對小鼠的全身SIRPα進行敲除，構(gòu)建高脂飲食模型誘導產(chǎn)生肥胖及代謝綜合癥，從體內(nèi)體外兩個水平對SIRPα通過免疫調(diào)節(jié)機制影響機體代謝的作用以及機制進行研究。
　　研究方法與結(jié)果：
　　第一部分 SIRPα參與調(diào)節(jié)正常飲食條件下小鼠代謝穩(wěn)態(tài)
　　取8周大小的雄性WT與SIRPα基因敲除小鼠，利用正常飼料連續(xù)喂養(yǎng)18周，并且每隔一周記錄小鼠體重與攝食量。觀察表型，我們發(fā)現(xiàn)在正常飲食模型下，S

5、IRPα基因敲除小鼠的體重增長無明顯差異，小鼠攝食量亦無顯著差異。通過血清生化檢測，我們發(fā)現(xiàn)WT與SIRPα敲除突變小鼠肝功能相關指標(AST以及ALT)無顯著差異。通過饑餓處理，我們觀察到SIRPα基因敲除組小鼠空腹血糖水平顯著高于WT組小鼠。血清胰島素的檢測發(fā)現(xiàn)SIRPα基因敲除小鼠的血清胰島素含量顯著高于WT組。IPGTT實驗發(fā)現(xiàn)相比于同窩的WT組小鼠，SIRPα基因敲除小鼠在注射葡萄糖后的早期階段血糖濃度快速升高，并且血糖降低水

6、平明顯減緩。ITT實驗發(fā)現(xiàn)SIRPα基因敲除小鼠胰島素敏感性低于WT組。
　　第二部分 SIRPα敲除減輕高脂誘導的小鼠胰島素抵抗與代謝異常
　　我們利用高脂飲食(HFD)與對照低脂飼料(LFD)喂養(yǎng)WT與SIRPα基因敲除小鼠。我們發(fā)現(xiàn)HFD喂養(yǎng)組中WT組小鼠體重增加顯著高于SIRPα基因敲除小鼠，表明高脂飲食條件下SIRPα基因敲除小鼠的代謝可能存在一定程度改善。進一步，我們檢測HFD與LFD喂養(yǎng)條件下WT組與SIRPα

7、基因敲除組小鼠血清生化以及代謝的相關指標。
　　結(jié)果：發(fā)現(xiàn)HFD組SIRPα基因敲除小鼠ALT、血清甘油三酯(TG)與血清膽固醇(TC)水平顯著低于WT組小鼠，AST無顯著差別，以上結(jié)果提示SIRPα基因敲除組小鼠代謝指標改善。除此之外，通過IPGTT實驗發(fā)現(xiàn)HFD處理中SIRPα基因敲除組小鼠糖耐量較WT組改善。ITT實驗表明SIRPα基因敲除組小鼠胰島素敏感性優(yōu)于WT組。通過以上結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)高脂飲食條件下SIRPα敲除組小鼠

8、糖代謝與胰島素敏感性有顯著改善。
　　第三部分 SIRPα影響小鼠的能量以及脂質(zhì)代謝
　　我們通過代謝籠的方法檢測正常飲食與高脂飲食條件下WT組與SIRPα基因敲除組小鼠攝食活動以及能量利用率的差異。發(fā)現(xiàn)正常飲食條件下WT組小鼠的活動率(Activity)水平高于SIRPα基因敲除組小鼠。同時我們發(fā)現(xiàn)WT組小鼠24小時的氧氣消耗量與二氧化碳呼出量均較SIRPα基因敲除組小鼠有所增加。高脂喂養(yǎng)組中，WT組小鼠的活動率低于SIR

9、Pα基因敲除組。相較于正常飲食組，高脂飲食條件下WT小鼠的整體活動率降低，而SIRPα基因敲除組小鼠無顯著差異。同時我們發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)條件下組WT小鼠24小時的氧氣消耗量與二氧化碳呼出量均較SIRPα基因敲除組小鼠有所減弱。以上結(jié)果提示高脂飲食條件下SIRPα敲除組小鼠能量利用率高于WT組，與SIRPα敲除組代謝指標改善的結(jié)果一致。
　　高脂喂養(yǎng)條件下，WT組肝臟體積明顯大于SIRPα基因敲除組，且肉眼可見顏色發(fā)白。進一步研究發(fā)現(xiàn)W

10、T組肝臟重量、肝體比均顯著高于SIRPα基因敲除組。WT組肝臟甘油三酯的水平亦高于SIRPα基因敲除組。通過定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)正常飲食條件下WT組與SIRPα基因敲除組小鼠肝臟脂肪酸合成代謝的相關基因如Acc1、Chrebp、Srebp2、Fasn、Acly、Pparg等水平無顯著差異。脂肪組織定量分析發(fā)現(xiàn)高脂飲食條件下WT組小鼠脂肪組織重量高于KO組小鼠。將脂肪組織按照部分進行區(qū)分發(fā)現(xiàn)，高脂飲食條件下WT組小鼠附睪脂肪組織(EAT)、

11、腎周脂肪組織(PAT)、腸系膜脂肪組織(MAT)、皮下脂肪組織(SAT)的重量均高于SIRPα基因敲除組小鼠，而棕色脂肪組織(BAT)的重量與SIRPα基因敲除組無顯著差別。通過定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)正常飲食條件下WT組與SIRPα基因敲除組小鼠脂肪酸從頭合成關鍵基因的表達水平無顯著差異。高脂飲食條件下，相比于WT組，SIRPα基因敲除組小鼠脂肪酸從頭合成基因表達水平降低。檢測了高脂飲食條件下小鼠BAT的產(chǎn)熱基因表達水平，我們發(fā)現(xiàn)SIRPα

12、基因敲除組小鼠BAT相關產(chǎn)熱基因Ucp1、Pparg、Prdm16、Cox7a1的表達水平高于WT組，提示SIRPα基因敲除組BAT的產(chǎn)熱能力高于WT組。HE染色發(fā)現(xiàn)高脂飲食條件下WT組WAT與BAT組織脂肪細胞體積顯著高于SIRPα基因敲除組。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)BAT組織中SIRPα基因敲除組UCP1的表達水平顯著高于WT組。以上結(jié)果提示SIRPα敲除抵抗高脂誘導的脂類新生，促進BAT組織產(chǎn)熱基因的表達。
　　糖原PAS染色結(jié)果顯

13、示，正常飲食條件下，相比于WT組，SIRPα基因敲除組小鼠肝臟內(nèi)糖原顯著累積。Glycogen定量檢測試劑盒檢測肝臟組織內(nèi)糖原含量，我們發(fā)現(xiàn)相比于WT組小鼠，SIRPα基因敲除組小鼠肝臟內(nèi)的糖原含量明顯增加。定量PCR結(jié)果顯示，正常飲食條件下SIRPα基因敲除組小鼠的糖原代謝相關基因Gsy、Gbe、GP(glycogen phosphorylase)中Gsy表達水平顯著上調(diào)。另外，定量PCR檢測糖異生通路中關鍵酶基因的表達，結(jié)果顯示相比

14、WT組，SIRPα基因敲除組小鼠的糖異生水平顯著升高。
　　高脂飲食條件下，PCR定量檢測的結(jié)果顯示，WT組以及SIRPα基因敲除組小鼠糖異生通路中關鍵酶基因的表達量沒有顯著差異。然而，檢測糖原代謝相關的基因的表達，我們發(fā)現(xiàn)相較于WT組，SIRPα基因敲除組小鼠的糖原合成以及分解均出現(xiàn)上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)高脂飲食下的肝臟糖原相較于正常飲食組出現(xiàn)了顯著的升高，這與高脂模型所致的糖原累積一致，不過WT組和SIRPα基因敲除組小鼠的肝臟糖原定

15、量差異減小。
　　第四部分 SIRPα參與調(diào)節(jié)正常飲食與高脂飲食條件下的小鼠免疫狀態(tài)
　　HE染色發(fā)現(xiàn)SIRPα基因敲除組小鼠肝臟組織存在較多炎性細胞浸潤。熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)正常飲食條件下SIRPα基因敲除組小鼠肝臟組織中炎性因子Ifng、Tnfa等表達水平顯著高于WT組，而抑炎因子IL4、IL13、IL10等表達水平低于WT組。F4/80染色顯示SIRPα基因敲除組小鼠肝臟中巨噬細胞的分布密度顯著高于對照組。ELISA

16、檢測驗證SIRPα基因敲除組肝臟組織中IL6、TNFα表達水平較高。以上結(jié)果提示正常飲食條件下敲除SIRPα促進小鼠肝臟炎癥。
　　同樣的檢測了高脂模型下小鼠的炎癥相關指標，HE染色顯示高脂飲食下WT組小鼠肝細胞脂肪變性程度高于SIRPα基因敲除組，這與WT組肝臟脂肪累積增多的結(jié)果相一致。免疫組化染色顯示W(wǎng)T組F4/80陽性巨噬細胞的分布密度高于SIRPα基因敲除組。定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)WT組小鼠肝臟炎性因子的表達水平高于SIRPα

17、基因敲除組。與此相一致的，SIRPα敲除抵抗高脂誘導的胰島素抵抗。以上結(jié)果提示高脂飲食下SIRPα敲除抑制肝臟炎癥狀態(tài)。
　　脂肪組織炎癥與脂質(zhì)代謝與脂肪細胞新生等相關，我們隨后檢測不同代謝狀態(tài)下脂肪組織免疫狀態(tài)。與肝臟組織類似，我們發(fā)現(xiàn)正常飲食條件下SIRPα敲除促進脂肪組織髓系細胞浸潤與加重脂肪組織炎癥，高脂飲食下SIRPα敲除抑制脂肪組織炎癥狀態(tài)。
　　研究結(jié)論：
　　根據(jù)以上結(jié)果并結(jié)合四部分的內(nèi)容，可以總結(jié)得到

18、：
　　1、SIRPα敲除會影響正常飲食下小鼠的代謝以及免疫穩(wěn)態(tài)，主要表現(xiàn)為糖代謝的異常以及血清胰島素水平升高，同時肝臟以及脂肪組織的炎癥顯著加重表現(xiàn)為促炎因子的表達上調(diào)以及抑炎因子的表達下調(diào)。
　　2、在高脂飲食構(gòu)建的肥胖模型中，我們觀察到截然不同的表型，主要表現(xiàn)為體重的下降、糖代謝的改善、血清胰島素的下降以及組織炎癥的減輕。
　　3、代謝籠的結(jié)果提示，正常飲食下SIRPα敲除會抑制小鼠的能量利用率。相反的，高脂飲食