SIRPα敲除對(duì)小鼠能量代謝的影響及機(jī)制的初步研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展以及人們飲食結(jié)構(gòu)的多元化，肥胖在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈現(xiàn)著逐年上升的趨勢(shì)。肥胖會(huì)引起2型糖尿病、腫瘤以及心腦血管疾病等，危害公共衛(wèi)生和人們的生命健康。心腦血管疾病以及腫瘤分別是現(xiàn)在造成人類死亡的第一以及第二位的重要因素。因而，對(duì)于肥胖的機(jī)制以及干預(yù)靶標(biāo)的研究則顯得尤為緊迫以及重要，除此之外還有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　脂肪組織不僅僅是機(jī)體存儲(chǔ)脂肪以及能量的器官，更是調(diào)節(jié)機(jī)體代謝以及能

2、量穩(wěn)態(tài)的重要器官，另有學(xué)者認(rèn)為脂肪組織更是一種內(nèi)分泌器官。隨著對(duì)于肥胖機(jī)制研究的深入，肥胖發(fā)生的炎癥機(jī)制也逐漸被人們所認(rèn)知，肥胖人群脂肪組織常常伴隨著慢性低度炎癥以及炎性細(xì)胞的浸潤。研究發(fā)現(xiàn)，生理狀態(tài)下的脂肪組織有少量的固有免疫細(xì)胞存在，并且通過分泌細(xì)胞因子招募單核巨噬細(xì)胞?；谝陨系难芯堪l(fā)現(xiàn)，我們也可以認(rèn)為脂肪組織是免疫系統(tǒng)以及代謝系統(tǒng)的紐帶，為兩者之間的密切聯(lián)系提供基礎(chǔ)。
　　肥胖相關(guān)組織的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致相關(guān)組織器官的胰島素敏

3、感性下降，組織器官胰島素抵抗的產(chǎn)生會(huì)進(jìn)一步加重組織代謝穩(wěn)態(tài)的失衡。代謝穩(wěn)態(tài)與免疫穩(wěn)態(tài)息息相關(guān)，相互作用。許多的研究發(fā)現(xiàn)，胰島素信號(hào)通路在炎癥發(fā)生的時(shí)候會(huì)受到NF-κB信號(hào)通路的影響進(jìn)而被顯著抑制。肥胖所致慢性炎癥反應(yīng)相關(guān)的炎癥信號(hào)通路的活化主要出現(xiàn)在胰島素敏感的靶器官，例如脂肪組織、肝臟、骨骼肌;這也反映了炎癥對(duì)于系統(tǒng)性胰島素抵抗的發(fā)生有著至關(guān)重要的作用。
　　但是，具體的代謝如何影響免疫以及免疫又如何影響代謝的機(jī)制仍不是很清楚。

4、本研究利用Talen基因敲除技術(shù)對(duì)小鼠的全身SIRPα進(jìn)行敲除，構(gòu)建高脂飲食模型誘導(dǎo)產(chǎn)生肥胖及代謝綜合癥，從體內(nèi)體外兩個(gè)水平對(duì)SIRPα通過免疫調(diào)節(jié)機(jī)制影響機(jī)體代謝的作用以及機(jī)制進(jìn)行研究。
　　研究方法與結(jié)果：
　　第一部分 SIRPα參與調(diào)節(jié)正常飲食條件下小鼠代謝穩(wěn)態(tài)
　　取8周大小的雄性WT與SIRPα基因敲除小鼠，利用正常飼料連續(xù)喂養(yǎng)18周，并且每隔一周記錄小鼠體重與攝食量。觀察表型，我們發(fā)現(xiàn)在正常飲食模型下，S

5、IRPα基因敲除小鼠的體重增長無明顯差異，小鼠攝食量亦無顯著差異。通過血清生化檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)WT與SIRPα敲除突變小鼠肝功能相關(guān)指標(biāo)(AST以及ALT)無顯著差異。通過饑餓處理，我們觀察到SIRPα基因敲除組小鼠空腹血糖水平顯著高于WT組小鼠。血清胰島素的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SIRPα基因敲除小鼠的血清胰島素含量顯著高于WT組。IPGTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相比于同窩的WT組小鼠，SIRPα基因敲除小鼠在注射葡萄糖后的早期階段血糖濃度快速升高，并且血糖降低水

6、平明顯減緩。ITT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SIRPα基因敲除小鼠胰島素敏感性低于WT組。
　　第二部分 SIRPα敲除減輕高脂誘導(dǎo)的小鼠胰島素抵抗與代謝異常
　　我們利用高脂飲食(HFD)與對(duì)照低脂飼料(LFD)喂養(yǎng)WT與SIRPα基因敲除小鼠。我們發(fā)現(xiàn)HFD喂養(yǎng)組中WT組小鼠體重增加顯著高于SIRPα基因敲除小鼠，表明高脂飲食條件下SIRPα基因敲除小鼠的代謝可能存在一定程度改善。進(jìn)一步，我們檢測(cè)HFD與LFD喂養(yǎng)條件下WT組與SIRPα

7、基因敲除組小鼠血清生化以及代謝的相關(guān)指標(biāo)。
　　結(jié)果：發(fā)現(xiàn)HFD組SIRPα基因敲除小鼠ALT、血清甘油三酯(TG)與血清膽固醇(TC)水平顯著低于WT組小鼠，AST無顯著差別，以上結(jié)果提示SIRPα基因敲除組小鼠代謝指標(biāo)改善。除此之外，通過IPGTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HFD處理中SIRPα基因敲除組小鼠糖耐量較WT組改善。ITT實(shí)驗(yàn)表明SIRPα基因敲除組小鼠胰島素敏感性優(yōu)于WT組。通過以上結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)高脂飲食條件下SIRPα敲除組小鼠

8、糖代謝與胰島素敏感性有顯著改善。
　　第三部分 SIRPα影響小鼠的能量以及脂質(zhì)代謝
　　我們通過代謝籠的方法檢測(cè)正常飲食與高脂飲食條件下WT組與SIRPα基因敲除組小鼠攝食活動(dòng)以及能量利用率的差異。發(fā)現(xiàn)正常飲食條件下WT組小鼠的活動(dòng)率(Activity)水平高于SIRPα基因敲除組小鼠。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)WT組小鼠24小時(shí)的氧氣消耗量與二氧化碳呼出量均較SIRPα基因敲除組小鼠有所增加。高脂喂養(yǎng)組中，WT組小鼠的活動(dòng)率低于SIR

9、Pα基因敲除組。相較于正常飲食組，高脂飲食條件下WT小鼠的整體活動(dòng)率降低，而SIRPα基因敲除組小鼠無顯著差異。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)條件下組WT小鼠24小時(shí)的氧氣消耗量與二氧化碳呼出量均較SIRPα基因敲除組小鼠有所減弱。以上結(jié)果提示高脂飲食條件下SIRPα敲除組小鼠能量利用率高于WT組，與SIRPα敲除組代謝指標(biāo)改善的結(jié)果一致。
　　高脂喂養(yǎng)條件下，WT組肝臟體積明顯大于SIRPα基因敲除組，且肉眼可見顏色發(fā)白。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)W

10、T組肝臟重量、肝體比均顯著高于SIRPα基因敲除組。WT組肝臟甘油三酯的水平亦高于SIRPα基因敲除組。通過定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)正常飲食條件下WT組與SIRPα基因敲除組小鼠肝臟脂肪酸合成代謝的相關(guān)基因如Acc1、Chrebp、Srebp2、Fasn、Acly、Pparg等水平無顯著差異。脂肪組織定量分析發(fā)現(xiàn)高脂飲食條件下WT組小鼠脂肪組織重量高于KO組小鼠。將脂肪組織按照部分進(jìn)行區(qū)分發(fā)現(xiàn)，高脂飲食條件下WT組小鼠附睪脂肪組織(EAT)、

11、腎周脂肪組織(PAT)、腸系膜脂肪組織(MAT)、皮下脂肪組織(SAT)的重量均高于SIRPα基因敲除組小鼠，而棕色脂肪組織(BAT)的重量與SIRPα基因敲除組無顯著差別。通過定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)正常飲食條件下WT組與SIRPα基因敲除組小鼠脂肪酸從頭合成關(guān)鍵基因的表達(dá)水平無顯著差異。高脂飲食條件下，相比于WT組，SIRPα基因敲除組小鼠脂肪酸從頭合成基因表達(dá)水平降低。檢測(cè)了高脂飲食條件下小鼠BAT的產(chǎn)熱基因表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)SIRPα

12、基因敲除組小鼠BAT相關(guān)產(chǎn)熱基因Ucp1、Pparg、Prdm16、Cox7a1的表達(dá)水平高于WT組，提示SIRPα基因敲除組BAT的產(chǎn)熱能力高于WT組。HE染色發(fā)現(xiàn)高脂飲食條件下WT組WAT與BAT組織脂肪細(xì)胞體積顯著高于SIRPα基因敲除組。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)BAT組織中SIRPα基因敲除組UCP1的表達(dá)水平顯著高于WT組。以上結(jié)果提示SIRPα敲除抵抗高脂誘導(dǎo)的脂類新生，促進(jìn)BAT組織產(chǎn)熱基因的表達(dá)。
　　糖原PAS染色結(jié)果顯

13、示，正常飲食條件下，相比于WT組，SIRPα基因敲除組小鼠肝臟內(nèi)糖原顯著累積。Glycogen定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肝臟組織內(nèi)糖原含量，我們發(fā)現(xiàn)相比于WT組小鼠，SIRPα基因敲除組小鼠肝臟內(nèi)的糖原含量明顯增加。定量PCR結(jié)果顯示，正常飲食條件下SIRPα基因敲除組小鼠的糖原代謝相關(guān)基因Gsy、Gbe、GP(glycogen phosphorylase)中Gsy表達(dá)水平顯著上調(diào)。另外，定量PCR檢測(cè)糖異生通路中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，結(jié)果顯示相比

14、WT組，SIRPα基因敲除組小鼠的糖異生水平顯著升高。
　　高脂飲食條件下，PCR定量檢測(cè)的結(jié)果顯示，WT組以及SIRPα基因敲除組小鼠糖異生通路中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量沒有顯著差異。然而，檢測(cè)糖原代謝相關(guān)的基因的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)相較于WT組，SIRPα基因敲除組小鼠的糖原合成以及分解均出現(xiàn)上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)高脂飲食下的肝臟糖原相較于正常飲食組出現(xiàn)了顯著的升高，這與高脂模型所致的糖原累積一致，不過WT組和SIRPα基因敲除組小鼠的肝臟糖原定

15、量差異減小。
　　第四部分 SIRPα參與調(diào)節(jié)正常飲食與高脂飲食條件下的小鼠免疫狀態(tài)
　　HE染色發(fā)現(xiàn)SIRPα基因敲除組小鼠肝臟組織存在較多炎性細(xì)胞浸潤。熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)正常飲食條件下SIRPα基因敲除組小鼠肝臟組織中炎性因子Ifng、Tnfa等表達(dá)水平顯著高于WT組，而抑炎因子IL4、IL13、IL10等表達(dá)水平低于WT組。F4/80染色顯示SIRPα基因敲除組小鼠肝臟中巨噬細(xì)胞的分布密度顯著高于對(duì)照組。ELISA

16、檢測(cè)驗(yàn)證SIRPα基因敲除組肝臟組織中IL6、TNFα表達(dá)水平較高。以上結(jié)果提示正常飲食條件下敲除SIRPα促進(jìn)小鼠肝臟炎癥。
　　同樣的檢測(cè)了高脂模型下小鼠的炎癥相關(guān)指標(biāo)，HE染色顯示高脂飲食下WT組小鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度高于SIRPα基因敲除組，這與WT組肝臟脂肪累積增多的結(jié)果相一致。免疫組化染色顯示W(wǎng)T組F4/80陽性巨噬細(xì)胞的分布密度高于SIRPα基因敲除組。定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)WT組小鼠肝臟炎性因子的表達(dá)水平高于SIRPα

17、基因敲除組。與此相一致的，SIRPα敲除抵抗高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗。以上結(jié)果提示高脂飲食下SIRPα敲除抑制肝臟炎癥狀態(tài)。
　　脂肪組織炎癥與脂質(zhì)代謝與脂肪細(xì)胞新生等相關(guān)，我們隨后檢測(cè)不同代謝狀態(tài)下脂肪組織免疫狀態(tài)。與肝臟組織類似，我們發(fā)現(xiàn)正常飲食條件下SIRPα敲除促進(jìn)脂肪組織髓系細(xì)胞浸潤與加重脂肪組織炎癥，高脂飲食下SIRPα敲除抑制脂肪組織炎癥狀態(tài)。
　　研究結(jié)論：
　　根據(jù)以上結(jié)果并結(jié)合四部分的內(nèi)容，可以總結(jié)得到

18、：
　　1、SIRPα敲除會(huì)影響正常飲食下小鼠的代謝以及免疫穩(wěn)態(tài)，主要表現(xiàn)為糖代謝的異常以及血清胰島素水平升高，同時(shí)肝臟以及脂肪組織的炎癥顯著加重表現(xiàn)為促炎因子的表達(dá)上調(diào)以及抑炎因子的表達(dá)下調(diào)。
　　2、在高脂飲食構(gòu)建的肥胖模型中，我們觀察到截然不同的表型，主要表現(xiàn)為體重的下降、糖代謝的改善、血清胰島素的下降以及組織炎癥的減輕。
　　3、代謝籠的結(jié)果提示，正常飲食下SIRPα敲除會(huì)抑制小鼠的能量利用率。相反的，高脂飲食