豬GPR120基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及miR-25對(duì)肌肉細(xì)胞能量代謝的抑制作用研究.pdf

1、能量代謝是動(dòng)物生長(zhǎng)、生產(chǎn)、繁育等重要生命活動(dòng)的基礎(chǔ);同時(shí)與人類代謝綜合癥等息息相關(guān)。因此，對(duì)能量代謝調(diào)控進(jìn)行研究不僅有助于提高動(dòng)物生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益同時(shí)對(duì)于改善人類健康也具有重大的意義。在本課題組前期的研究中，通過對(duì)大白豬的組織表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)GPR120是差異表達(dá)基因。GPR120基因參與能量平衡的多個(gè)生理過程，調(diào)節(jié)全身性能量和營養(yǎng)代謝平衡。本研究擬對(duì)GPR120基因進(jìn)行研究，分析研究GPR120基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，揭示GPR120基因在能

2、量代謝調(diào)控過程的作用。本研究還基于胚胎期大白豬和通城豬的背最長(zhǎng)肌組織的Solexa測(cè)序獲得miR-25，通過分析miR-25序列，預(yù)測(cè)靶基因并進(jìn)行功能分析驗(yàn)證;同時(shí)對(duì)miR-25的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行初步研究，探尋轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)miR-25轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.豬GPR120基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究
　　基于預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)域CpG島分布情況構(gòu)建GPR120基因啟動(dòng)子區(qū)域的缺失片段雙熒光素酶載體，雙熒光結(jié)果顯示缺

3、失片段P5(-323/+165)是GPR120基因核心啟動(dòng)子區(qū)域。使用TFSEARCH ver.1.3網(wǎng)站預(yù)測(cè)GPR120基因核心啟動(dòng)子區(qū)域中有與能量代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ的結(jié)合位點(diǎn)(TGTCG);而且在人、小鼠和豬三個(gè)物種，GPR120啟動(dòng)子區(qū)域中的C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)高度保守。通過定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)的突變顯著地抑制了GPR120啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性;而且通過ChIP實(shí)驗(yàn)表明，在體內(nèi)環(huán)境中，轉(zhuǎn)錄因子C/E

4、BPβ可以與GPR120基因核心啟動(dòng)子結(jié)合。超表達(dá)C/EBPβ顯著性促進(jìn)了GPR120和PPARγ基因的表達(dá);而干涉C/EBPβ的表達(dá)則顯著性抑制了GPR120基因的表達(dá)。此外，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，高能飼喂(HFD-feeding)能夠促進(jìn)小鼠脂肪組織中GPR120，C/EBPβ和PPAR-γ2基因的表達(dá)，并且能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ與GPR120基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力。
　　2.miR-25在肌肉細(xì)胞能量代謝中的作用

5、r>　　對(duì)C2Cl2成肌細(xì)胞進(jìn)行成肌誘導(dǎo)分化，檢測(cè)結(jié)果表明:小鼠miR-25-3p的表達(dá)量在C2Cl2成肌細(xì)胞分化過程中呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的變化趨勢(shì)。在轉(zhuǎn)染miR-25-3pmimics的實(shí)驗(yàn)組中，檢測(cè)結(jié)果表明肌肉細(xì)胞能量代謝的標(biāo)志基因PI3K、Map2k4的表達(dá)水平顯著下降。運(yùn)用多種miRNA靶基因預(yù)測(cè)生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-25-3p靶基因，發(fā)現(xiàn)Akt1基因的3'UTR區(qū)域有miR-25-3p的結(jié)合位點(diǎn)，而且序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)

6、物中Akt1基因的miR-25靶位點(diǎn)序列具有高度的保守性。雙熒光結(jié)果顯示，miR-25-3p顯著地抑制了Akt1-3'UTR的熒光活性，說明miR-25-3p能夠識(shí)別Akt1基因的3'UTR上的miR-25-3p靶位點(diǎn)并與其發(fā)生特異性結(jié)合。超表達(dá)miR-25-3p可以顯著性下調(diào)Akt1和PI3K基因的mRNA表達(dá)水平;與此同時(shí)，miR-25-3p的超表達(dá)導(dǎo)致了Akt1和PI3K蛋白表達(dá)水平的下降。
　　總之，miR-25-3p可以

7、靶向基因Akt1，并抑制Akt1在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)，進(jìn)而可能影響PI3K/Akt信號(hào)通路的活化，調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞的能量代謝過程。
　　3.小鼠miR-25轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究
　　本研究中，我們克隆了小鼠miR-25-3p的5'端上游區(qū)域2034bp序列并構(gòu)建miR-25-3p啟動(dòng)子區(qū)域缺失片段熒光載體，熒光活性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失片段miR-25-3p-P9（-119/+144）是miR-25的核心啟動(dòng)子區(qū)域。使用生物信

8、息學(xué)網(wǎng)站對(duì)miR-25核心啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子AP-2α結(jié)合位點(diǎn)。定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子AP-2α結(jié)合位點(diǎn)的突變顯著地抑制了miR-25啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。通過ChIP-Q-PCR實(shí)驗(yàn)證明:在體內(nèi)環(huán)境中，轉(zhuǎn)錄因子AP-2α可以與miR-25啟動(dòng)子發(fā)生特異性地結(jié)合。而且通過ChIP-Q-PCR實(shí)驗(yàn)證明與C2Cl2細(xì)胞分化第8d相比，轉(zhuǎn)錄因子AP-2α與miR-25啟動(dòng)子在C2Cl2細(xì)胞分化第0d時(shí)結(jié)合能

9、力更強(qiáng)。超表達(dá)AP-2α可以顯著促進(jìn)miR-25啟動(dòng)子的活性;而且超表達(dá)AP-2α可以顯著性提高miR-25的mRNA表達(dá)量，同時(shí)也可以下調(diào)miR-25靶基因Akt1的mRNA和蛋白表達(dá)水平;與此一致，干涉AP-2α的表達(dá)顯著性抑制了miR-25的mRNA表達(dá)量，同時(shí)也提高了基因Akt1的mRNA和蛋白表達(dá)量。
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明AP-2α在miR-25轉(zhuǎn)錄過程中有著重要的調(diào)控作用，并且能夠識(shí)別miR-25核心啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因