不同栽培品種靈芝抗氧化作用及靈芝多糖分離純化、免疫活性研究.pdf

1、靈芝（Ganoderma）是一種多孔菌科真菌類藥材，《中國藥典》（2010版一部）規(guī)定靈芝為赤芝Ganoderma lucidum(leyss. ex Fr.) Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang干燥的子實體。靈芝作為我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中最負(fù)盛名的珍貴藥材之一，藥用歷史已有2000多年。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為靈芝具“扶正固本、補中益氣、延年益壽”的功效，現(xiàn)代研究表明靈芝具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、降

2、血糖及降血脂等多種作用，在食品、化妝品、保健食品及藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有廣闊的前景，靈芝含有多糖、三萜、生物堿等有效成分，其中靈芝多糖（Ganoderma lucidum Polysaccharide，GLP）是主要的活性物質(zhì)之一。
　　本研究通過比較不同栽培品種靈芝提取物清除羥自由基、清除超氧陰離子、清除DPPH作用以及酪氨酸酶抑制活性的大小來評價其抗氧化能力的差別；采用水提醇沉、超濾膜過濾分級、離子交換和凝膠過濾等分離純化技術(shù)對靈

3、芝子實體多糖進(jìn)行分離純化，并運用物理、化學(xué)手段初步研究多糖的性質(zhì)、構(gòu)型、單糖組成、分子量；在體外進(jìn)行對靈芝多糖免疫活性的評價，內(nèi)容包含：對大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，對RAW264.7巨噬細(xì)胞生成NO能力、吞噬能力、增殖的影響，靈芝多糖的免疫活性。實驗包含以下內(nèi)容：
　　1.不同栽培品種靈芝提取物的抗氧化作用研究
　　通過對ZLa（靈芝a），ZLb（靈芝b），ZLc（靈芝c），ZLd（靈芝d），ZLe（靈芝e），ZLf（靈芝f

4、）6個不同栽培品種品種的靈芝樣品的清除羥自由基、清除超氧陰離子、清除DPPH作用以及酪氨酸酶抑制活性為評價指標(biāo)，研究靈芝水提取物和醇提物的抗氧化作用，結(jié)果表明6種靈芝的醇提物和水提物對DPPH都具有很強(qiáng)的清除作用，其中Zld水提物作用最強(qiáng)，IC50為0.03 g·L-1。僅Zld水提物和醇提物同時具有清除超氧陰離子的作用。ZLb、ZLc及ZLd的提取物同時具有清除羥自由基的作用，其中ZLd的水提物對羥自由基清除作用最好，IC50值為7.

5、14 g·L-1。6種靈芝的醇提物具有很強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性，其中ZLd作用最強(qiáng)。而6種靈芝水提物的酪氨酸酶抑制活性較醇提物弱，在10 g·L-1濃度時ZLd具有較高的活性，抑制率為66.77％。
　　2.靈芝多糖的提取、分離與純化
　　2.1靈芝多糖的提取
　　本實驗采用傳統(tǒng)水提醇沉的方法從靈芝子實體中提取靈芝多糖，綜合考慮多方面因素確定靈芝多糖的提取條件為：料液比（1∶20），提取溫度（90℃），提取時間（3h），

6、提取次數(shù)(2次)。利用多糖不溶于高濃度的乙醇的性質(zhì)，在多糖提取液中加入乙醇至乙醇終濃度為80%，于4℃下靜置24h，然后離心得到靈芝多糖粗提物。
　　2.2靈芝多糖的除蛋白
　　因為靈芝多糖粗提物中往往不可避免含有與蛋白共價鍵結(jié)合的蛋白多糖以及游離的蛋白質(zhì)和多肽，在純化多糖必須除去蛋白質(zhì)，本實驗采用Sevag法除蛋白具體的實驗方法為為：按多糖提取液體積的1/4加入 Sevag試劑，振蕩后靜置,最后離心除去蛋白質(zhì)層，重復(fù)數(shù)次直

7、至無蛋白質(zhì)層。
　　2.3靈芝多糖的透析
　　提取的靈芝多糖含有無機(jī)鹽等小分子化合物，實驗方法為：將靈芝多糖提取液裝入已預(yù)處理的透析袋中，放在蒸餾水下透析72h，然后冷凍干燥得到靈芝多糖粗提取物。
　　2.4靈芝多糖的超濾膜過濾分級
　　超濾是一種利用壓力推動的膜分離過程，從而分離不同粒徑大小的化合物。超濾膜過濾分級可以將多糖樣品按分子量的大小初步粗分成幾段，具體的實驗方法為：將靈芝粗多糖粉末用適量的蒸餾水溶解，

8、多糖溶液經(jīng)0.45μm的濾膜過濾后，依次用Biomax5、10（KD）依次過濾，別得到GLPⅠ、GLPⅡ、GLPⅢ三個部分。這種用超濾法而得到的多糖溶液，只是一個具有分子量寬分布的組分，要想獲得更純的多糖樣品，則需要進(jìn)行進(jìn)一步純化。
　　2.5靈芝多糖的柱層析分離純化
　　離子交換色譜法與分子篩凝膠過濾聯(lián)合使用是多糖組分最常用的純化方法。離子交換色譜法其原理是以離子層析填料為固定相,根據(jù)不同組分多糖與離子填料電荷不同與吸附度

9、不同，用不同極性溶解極性洗脫來實現(xiàn)不同組分多糖的分離。此法可適用于中性多糖、酸性多糖和粘性多糖的純化，同時纖維素離子交換樹脂可以除去樣品中具有極性的色素。本實驗采用DEAE-Cellulose52陰離子交換柱，將GLPⅠ、GLPⅡ、GLPⅢ三個部分分別經(jīng)過柱層析分離純化，根據(jù)收集樣品的洗脫曲線GLPⅠ有2個多糖峰，分別命名為GLP1、GLP2；GLPⅡ有一個多糖峰，命名為GLP3；GLPⅢ有2個多糖峰，分別命名為GLP4、GLP5。

10、r>　　凝膠過濾是一種分子篩的原理，利用分子量大小的差異，分子量大的多糖組分，其保留時間短，就會先被洗脫劑洗脫下來，分子量小的多糖則相反，以達(dá)到純化多糖的目的。本實驗采用Sephacryl S-300 HR凝膠過濾層析將GLP1、GLP2、GLP3、GLP4、GLP5五個組分進(jìn)一步分離純化。
　　3.GLP的性質(zhì)結(jié)構(gòu)特征研究
　　3.1 GLP的溶解性和KI-I反應(yīng)
　　將GLP1、GLP2、GLP3、GLP4、GLP

11、5分別溶解于水、乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯及三氯甲烷等溶劑中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLP1、GLP2、GLP3、GLP4、GLP5都溶于水，粘度較大；不溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇及三氯甲烷等有機(jī)溶劑中。
　　稱取GLP1、GLP2、GLP3、GLP4、GLP5各1.0mg，用蒸餾水定容至2.0 ml。將這5種多糖溶液中分別加入KI-I溶液，觀察溶液的顏色變化，同時用蒸餾水為陰性對照，0.5 mg.ml-1的淀粉溶液為陽性對照，結(jié)果顯示

12、：GLP1、GLP2、GLP3、GLP4、GLP5的碘-碘化鉀反應(yīng)均為陰性，表明GLP中不含有淀粉。
　　3.2 GLP的多糖含量測定
　　采用苯酚-硫酸法對GLP1、GLP2、GLP3、GLP4、GLP5的多糖含量進(jìn)行測定，測定結(jié)果為：GLP1、GLP2、GLP3、GLP4、GLP5的多糖含量依次為96.54%、97.35%、97.57%、96.58%、97.13%。
　　3.3 GLP的單糖組分分析
　　單糖

13、組分分析發(fā)現(xiàn)，GLP以葡萄糖為主，還有甘露糖和半乳糖，他們的甘露糖、半乳糖、葡萄糖的組成百分比約為GLP1（17%、14%、69%）、GLP2（19%、24%、57%）、GLP3（15%、13%、72%）、GLP4（20%、17%、63%）、GLP5（14%、21%、65%）。
　　3.4 GLP的分子量的測定
　　以已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖DeTran T系列（T2000、T500、T200、T70、T20）為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)HPL

14、C-ELSD測定其保留時間，根據(jù)保留時間與葡聚糖分子量的對數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為lgMR=-0.183tR+7.978（R2=0.994），將GLP1、GLP2、GLP3、GLP4、GLP5的保留時間代入回歸曲線計算出分子量依次為5.93、7.24、8.43、10.51、12.77KD。
　　3.5 GLP的紅外光譜分析
　　通過紅外光譜對GLP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，初步判斷 GLP為β-吡喃型多糖。
　　4、GLP的體外免疫實驗

15、
　　選取大鼠脾淋巴細(xì)胞和RAW264.7巨噬細(xì)胞兩種典型模型初步評價GLP1、GLP2、GLP3、GLP4、GLP5的免疫活性，具體的評價指標(biāo)包含：對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響、對RAW264.7巨噬細(xì)胞生成NO能力、吞噬能力、增殖的影響。4.1 GLP對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響
　　實驗結(jié)果顯示不同濃度的GLP單獨作用于小鼠淋巴細(xì)胞時，具有促增殖作用。當(dāng)有LPS或ConA存在時，GLP能夠協(xié)同刀豆蛋白和脂多糖促進(jìn)其脾淋巴細(xì)胞的增殖

16、作用。ConA的協(xié)同促小鼠淋巴細(xì)胞增殖作用強(qiáng)于LPS的協(xié)同促進(jìn)作用。同時隨著GLP1、GLP2、GLP3、GLP4、GLP5分子量的增大，對大鼠的脾淋巴細(xì)胞的增殖作用也更加明顯。
　　4.2 GLP對RAW264.7巨噬細(xì)胞生成NO能力、吞噬能力、增殖的影響
　　實驗結(jié)果表明：不同濃度的GLP能夠明顯的促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞NO的生成，并呈現(xiàn)明確的劑量依賴關(guān)系，隨著GLP1、GLP2、GLP3、GLP4、GLP5分子量