神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子Semaphorin 3A在人頭頸鱗癌中的表達、作用及分子機制的研究.pdf

1、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC，以下簡稱鱗癌）是最常見的頭頸部惡性腫瘤，具有較強的局部浸潤和轉(zhuǎn)移能力，惡性程度往往較高。神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子3A(Semaphorin3A，SEMA3A)是Semaphorin(SEMA)家族的成員。SEMA家族是一類廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)的蛋白，對神經(jīng)軸突的導(dǎo)向、成束、分支及突觸形成具有重要的調(diào)控作用。近來，大量研究證實SEMA3亞族的成

2、員能抑制多種惡性腫瘤的生長，因此其具有重要的診療價值，且可作為一種潛在的治療靶點。目前尚未有確切的研究資料表明SEMA3A在人類腫瘤包括頭頸癌中的表達及其作用。本研究擬探討SEMA3A在頭頸癌中的表達及其功能和相關(guān)的機制。
　　目的:
　　1、觀察SEMA3A在人頭頸鱗癌標(biāo)本中的表達，評價SEMA3A的表達水平與頭頸鱗癌臨床病理以及預(yù)后的關(guān)系;
　　2、觀察SEMA3A對頭頸鱗癌移植瘤生長的影響;
　　3、明確S

3、EMA3A對頭頸鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;
　　4、初步探討SEMA3A對頭頸鱗癌作用的分子生物學(xué)機制。
　　方法:
　　1、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測100例人頭頸鱗癌標(biāo)本及20例正常頭頸粘膜組織標(biāo)本中SEMA3A的表達高低;統(tǒng)計分析SEMA3A表達水平與腫瘤臨床病理以及預(yù)后的關(guān)系。
　　2、構(gòu)建HNSCC的裸鼠移植瘤動物模型，利用能夠過表達SEMA3A的腺病毒pAdCMV-SEMA3A-MCS-EGFP及

4、空載病毒pAdCMV-MCS-EGFP分次多點注射于移植瘤瘤內(nèi)及瘤周，觀察SEMA3A過表達后腫瘤生長的大小變化。
　　3、將pAdCMV-SEMA3A-MC S-EGFP腺病毒及pAdCMV-MCS-EGFP空載病毒感染HNSCC細(xì)胞系，獲得瞬時高表達SEMA3A的細(xì)胞株（實驗組）及相對低表達SEMA3A的細(xì)胞株（對照組）;同時利用siRNA抑制HNSCC細(xì)胞中SEMA3A的表達，觀察病毒感染及siRNA抑制使SEMA3A表達改

5、變后細(xì)胞表型的變化;應(yīng)用RT-qRCR、Western blot方法分別檢測兩組細(xì)胞中SEMA3A以及上皮和間充質(zhì)標(biāo)志物基因水平和蛋白水平的表達變化;應(yīng)用RT-qRCR、Westernblot、CCK-8、克隆形成實驗、TUNEL染色等方法分析SEMA3A對HNSCC細(xì)胞及移植瘤組織的增殖、侵襲、凋亡、細(xì)胞周期等相關(guān)分子生物學(xué)作用的影響。
　　4、應(yīng)用RT-qRCR、Western blot等實驗方法，研究SEMA3A在HNSCC

6、細(xì)胞及組織中發(fā)揮抑癌作用的潛在機制。
　　結(jié)果:
　　1、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:20例正常組織中18例檢測出SEMA3A高表達，而100例頭頸鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中只有43例檢測出SEMA3A高表達，表明SEMA3A在腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達(p＜0.001); SEMA3A的表達與頭頸鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級、臨床分期密切相關(guān)(p＜0.05);生存分析表明SEMA3A高表達組患者總體生存率明顯高于低表達組患者(p＜0.05)。

7、
　　2、通過構(gòu)建HNSCC裸鼠移植瘤模型發(fā)現(xiàn)，多次多點注射SEMA3A腺病毒于移植瘤瘤內(nèi)及瘤周，能夠明顯抑制腫瘤的生長且誘導(dǎo)組織的凋亡。
　　3、SEMA3A的高表達明顯抑制了HNSCC細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT，epithelial-mesenchymal transition)進程，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，上皮標(biāo)志物E-cadherin和β-catenin表達升高，間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin

8、表達下降。細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖能力顯著降低，且細(xì)胞周期受到抑制，同時細(xì)胞凋亡現(xiàn)象顯著。
　　4、通過腺病毒感染使SEMA3A過表達后，NF-κB通路、SNAI2明顯受抑制，Caspase-5和Caspase-7明顯被激活;而通過siRNA抑制SEMA3A后，NF-κB通路、SNAI2被激活，Caspase-5和Caspase-7隨即受抑制，提示SEMA3A可能通過NF-κB和SNAI2抑制遷移、侵襲和EMT進程，通過Caspas

9、e通路介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論:
　　本實驗證實SEMA3A在人頭頸鱗狀細(xì)胞癌組織中呈低表達，與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級、臨床分期及患者的生存率密切相關(guān)，提示SEMA3A的異常表達可能與頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且可作為一種新的生物學(xué)標(biāo)志物用于患者的診斷和預(yù)后的預(yù)測。其次，SEMA3A能通過降低細(xì)胞的增殖能力、促進凋亡來抑制頭頸癌腫瘤的生長，可能通過抑制NF-κB、SNAI2信號通路來抑制頭頸鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT，降低其遷