神經(jīng)軸突導向分子Semaphorin 5A在人胃癌中表達、作用及其分子機制的研究.pdf

1、胃癌是最常見、死亡率最高的惡性腫瘤之一。其中主要原因是胃癌的病因、發(fā)展機制還不十分了解。因此，探討胃癌的病因、發(fā)病機制和尋找新的診斷標志物具有重大的臨床意義，并為發(fā)展新的治療策略提供有力的理論依據(jù)。
　　 Semaphorin5A是神經(jīng)軸突導向分子Semaphorins家族成員之一，最初是在腦神經(jīng)生長、發(fā)育過程中得到一定程度的認識，其主要功能是起化學排斥作用，調(diào)控軸突的生長方向，引導軸突進入正確的位置并建立起突觸聯(lián)系。最近的研究

2、資料表明，Semaphorin家族的部分成員在神經(jīng)系統(tǒng)以外不同組織中表達，參與了中樞神經(jīng)以外的活動，其中最令人注意的是，他們在人類多種腫瘤組織中表達，調(diào)控腫瘤的發(fā)生和影響腫瘤形成的進程。Semaphorin5A是Semaphorins家族成員，目前尚未有確切的研究資料表明Semaphorin5A在人類腫瘤包括胃癌中的表達及其作用。本研究擬探討Semaphorin5A在胃癌中表達及其功能和相關(guān)機制。
　　 目的：檢測Semapho

3、rin5A在胃癌中的表達，探討Semaphorin5A在胃癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的作用和機制，為以Semaphorin5A作為靶的胃癌基因治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、Western blotting方法檢測Semaphorin5A在不同胃癌細胞系中的表達；使用免疫組織化學、Western blotting和real-time RT-PCR方法檢測S

4、emaphorin5A在胃癌組織及其相對應的正常胃黏膜組織中的表達并分析其與臨床病理特征之間的相關(guān)性。
　　 2.通過細菌轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切、凝膠電泳、基因測序鑒定和基因重組技術(shù)等方法構(gòu)建針對Semaphorin5A的RNAi質(zhì)粒(pGen-1-SEMA5A)和陰性對照質(zhì)粒(pGen-1-scrambled)并轉(zhuǎn)染具有侵襲能力的人胃癌細胞系SGC7901細胞，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定Semaphorin5A表達抑制的胃癌細胞模型

5、pGen-1-SEMA5A(si-Sema5A)。采用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染組pGen-1-Sema5A(si-Sema5A)、對照組pGen-1-Scrambled(si-Scrambled)及未轉(zhuǎn)染組SGC7901三組細胞中Semaphorin5A的表達，以證實轉(zhuǎn)染效果。
　　 3.運用MTT比色法、軟瓊脂克隆形成實驗檢測siRNA-Semaphorin5A對胃癌細胞增殖、生長能力的影響；使用流式細胞儀和ELISA方法檢測si

6、RNA-Semaphorin5A對胃癌細胞凋亡的影響；使用黏附、運動、侵襲實驗檢測siRNA-Semaphorin5A對胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 4.以si-Sema5A、SGC7901細胞為研究對象，使用ELISA、RT-PCR方法檢測siRNA-Semaphorin5A對MMP2、MMP9、uPA和pERK表達的影響；使用抗MMP2、MMP9、uPA抗體和ERKs抑制劑PD98059處理細胞，比較si-Sema5

7、A、SGC7901在處理前后侵襲能力的變化以及MMP2、MMP9、uPA在PD98059處理后的表達改變，以確定Semaphorin5A是否通過ERKs信號通路調(diào)控MMP2、MMP9、uPA的表達介導胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 5.使用ELISA、RT-PCR/Western blotting方法檢測TGF-β1及其靶向基因PAI-1在si-Sema5A、SGC7901細胞中的表達水平和Smad2的磷酸化水平，為Semaphorin

8、5A是否能夠激活TGF-β1提供理論依據(jù)；將siRNA-TGF-β1瞬時轉(zhuǎn)染si-Sema5A、SGC7901細胞，并比較兩種細胞在轉(zhuǎn)染前后ERK磷酸化水平和侵襲能力的改變，以決定Semaphorin5A是否通過激活TGF-β1，依賴ERKs信號通路調(diào)控MMP2、MMP9、uPA的表達介導胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)果：
　　 1.Semaphorin5A在胃癌細胞系中廣泛表達，并且在具有轉(zhuǎn)移能力的胃癌細胞系(SGC790

9、1、MKN45)中的表達高于在非轉(zhuǎn)移能力的胃癌細胞系(AGS，SNU-1)(P<0.01)； Semaphorin5A在胃癌組織的表達高于對應的正常胃粘膜組織，Semaphorin5A的表達與胃癌TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分型有關(guān)，與年齡、性別、胃癌浸潤深度無關(guān)。
　　 2.siRNA-Semaphorin5A抑制胃癌細胞生長、增殖、黏附、運動、侵襲能力，促進凋亡。
　　 3.與SGC7901細胞相比，MMP9、uP

10、A、pERK在si-Sema5A中表達下調(diào)，MMP2表達無變化；和si-Sema5A細胞比較，抗MMP9、uPA抗體明顯降低SGC7901細胞的侵襲能力，MEK/ERK特殊抑制劑PD98059顯著下調(diào)MMP9、uPA表達，并抑制其的侵襲能力。
　　 4.和SGC790細胞比較，TGF-β1及其靶向基因PAI-1表達水平、Smad2磷酸化水平在si-Sema5A中下調(diào)，siRNA-TGF-β1明顯降低ERK在SGC7901細胞中磷