軸突導(dǎo)向分子Sema4D在心血管和肥胖相關(guān)疾病中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、Sema4D是軸突導(dǎo)向分子Semaphorin家族成員，又被稱為CD100，其作用除了調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突導(dǎo)向、血管新生、腫瘤轉(zhuǎn)移外，在免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮了重要作用。Sema4D是一個(gè)分子量150kD的跨膜蛋白，在免疫細(xì)胞和血小板中表達(dá)，目前對(duì)Sema4D的研究主要集中在其生理作用，其在病理過程中的作用和機(jī)制越來越受到重視。我們實(shí)驗(yàn)室的前期結(jié)果表明Sema4D在血栓形成和心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，我們擬對(duì)其在其他心血管疾病如心衰和肥胖相關(guān)

2、疾病中的作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　目的:
　　1研究Sema4D在心衰病人血漿中的水平和來源
　　心力衰竭是各種嚴(yán)重心臟疾病的共同通路，死亡率與惡性腫瘤相仿，目前對(duì)于心力衰竭的治療方法非常有限，同時(shí)也需要一些簡(jiǎn)便易行的診斷方法。免疫反應(yīng)在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，有些炎癥因子可以作為心衰的診斷指標(biāo)，如腫瘤壞死因子（TNF）等。Sema4D是表達(dá)在 T細(xì)胞、血小板等表面的跨膜蛋白，具有活化 T細(xì)胞和血小板的功能，

3、在活化過程中可以被切割釋放出有活性的可溶性片段。因此我們推測(cè) Sema4D可能會(huì)參與心力衰竭過程，并且可以作為生物標(biāo)志物用于心力衰竭的診斷，為了證明這一假設(shè)，我們將利用臨床樣本，(1)測(cè)定心衰病人血漿中可溶性 Sema4D的水平；(2)研究 Sema4D表達(dá)水平與心衰患者疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系，探討其在心衰患者的診斷和疾病程度評(píng)估中的意義；(3)并初步探討心衰患者血漿Sema4D高表達(dá)的細(xì)胞機(jī)制。
　　2研究Sema4D在肥胖和脂肪肝

4、中的作用和機(jī)制
　　肥胖是2型糖尿病和許多心血管疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素，而脂肪組織的長(zhǎng)期慢性炎癥反應(yīng)是肥胖誘導(dǎo)相關(guān)疾病的重要原因。由于 Sema4D在免疫細(xì)胞中的作用，我們推測(cè) Sema4D可能會(huì)通過活化 T細(xì)胞等促進(jìn)脂肪炎癥；同時(shí)由于 Sema4D可以通過其受體PlexinB1調(diào)節(jié)Rho的活性，而Rho通路對(duì)于脂肪分化有重要調(diào)節(jié)作用，Sema4D也可能通過 PlexinB1影響脂肪分化，參與肥胖相關(guān)疾病。為了證明我們的假說，我們利用

5、基因工程小鼠以及高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖和脂肪肝模型，(1)研究 Sema4D及其受體 PlexinB1在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和脂肪肝中的作用；(2)初步探究Sema4D和PlexinB1調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和脂肪肝的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1建立可溶性Sema4D的ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)正常人和心衰病人外周血中Sema4D的水平
　?、趴扇苄許ema4D的ELISA檢測(cè)方法的建立
　　擴(kuò)增含有His標(biāo)簽標(biāo)記的

6、Sema4D的細(xì)胞外段的 pSecTag2B質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用親和層析法分離純化上清中的Sema4D蛋白，作為標(biāo)準(zhǔn)品。以可溶性 Sema4D蛋白作為抗原免疫小鼠，制備10株單克隆抗體，從中篩選兩株分別作為包被抗體和檢測(cè)抗體，檢測(cè)抗體標(biāo)記 HRP。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立夾心ELISA方法。
　　⑵正常人和心衰病人外周血中Sema4D水平檢測(cè)
　　收集126位正常人的 EDTA抗凝外周血，離心

7、取血漿。ELISA方法測(cè)定血漿中可溶性 Sema4D的水平，分析不同性別和年齡的正常人外周血中 Sema4D的差異。通過流式細(xì)胞術(shù)和Western blot分析17β雌二醇對(duì)Jurkat細(xì)胞和血小板表面Sema4D表達(dá)的影響。
　　收集157例心衰病人的 EDTA抗凝外周血，離心取血漿，統(tǒng)計(jì)這些病人的基本資料包括年齡、性別、并發(fā)癥等。用建立的 ELISA方法檢測(cè)病人血漿中Sema4D的表達(dá)，比較心衰病人和正常人血漿 Sema4D水

8、平及其與年齡和性別的關(guān)系，并分析不同并發(fā)癥如糖尿病或者高血壓對(duì)心衰病人血漿中 Sema4D表達(dá)的影響。
　　2心衰病人外周血T細(xì)胞、B細(xì)胞、血小板表面Sema4D的表達(dá)。
　　(1)通過Ficoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離心衰病人（HF）和正常人（HD）外周血淋巴細(xì)胞，分別用CD3和CD19的抗體標(biāo)記T細(xì)胞和B細(xì)胞，同時(shí)孵育Sema4D抗體，流式分析T細(xì)胞和B細(xì)胞表面Sema4D的表達(dá)情況。
　　(2)流式檢測(cè)心

9、衰病人和正常人外周血中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面Sema4D的表達(dá)。
　　(3)通過同時(shí)孵育Sema4D和CD41抗體，流式檢測(cè)正常人和心衰病人血小板表面Sema4D的表達(dá)。
　　3檢測(cè)Sema4D敲除對(duì)高脂誘導(dǎo)的肥胖和脂肪肝的影響
　　(1)收集2型糖尿病病人和正常對(duì)照的外周血漿，ELISA方法檢測(cè)血漿中
　　可溶性Sema4D的表達(dá)水平；取正常飲食（chow diet）和高脂飲食（HFD）的小鼠，取內(nèi)

10、臟脂肪組織提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Sema4D及其受體PlexinB1、PlexinB2和CD72的表達(dá)。
　　(2)每5-7天稱量高脂飲食喂養(yǎng)（8-10周）的WT和Sema4D-/-小鼠體重，
　　觀測(cè)小鼠的體重變化，同時(shí)檢測(cè)高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的脂肪含量以及血脂變化，以及葡萄糖耐受性。
　　(3)取分別高脂喂養(yǎng)8周和16周的WT和Sema4D-/-小鼠肝臟，稱量，
　　肝臟冷凍包埋盒石蠟

11、包埋后切片，分別油紅 O染色和 HE染色，顯微鏡下觀察和拍照，分析脂肪肝的嚴(yán)重程度。
　　(4)取高脂飲食喂養(yǎng)8-10周的 WT和 Sema4D-/-小鼠，分離生殖器脂肪組織細(xì)胞后，流式細(xì)胞分析兩組小鼠脂肪組織中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，包括 CD45+細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、F4/80+巨噬細(xì)胞、CD11+M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量和比例的變化。
　　4體外觀察Sema4D對(duì)脂肪分化的影響
　　取6-8周小鼠，分離脂肪

12、組織，膠原酶消化后離心去除上層脂肪細(xì)胞，下層基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)3代后，流式檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物的表達(dá)，并轉(zhuǎn)染對(duì)照和表達(dá)Sema4D細(xì)胞外段的質(zhì)粒，加入脂肪分化誘導(dǎo)劑，分化7天后油紅 O染色觀察Sema4D對(duì)脂肪分化的影響。
　　5研究PlexinB1敲除對(duì)高脂誘導(dǎo)的肥胖和脂肪肝的影響
　　取WT和PlexinB1-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)8-10周，觀察小鼠的體重變化，脂肪含量，肝臟冷凍包埋后油紅O染色觀察脂肪肝的嚴(yán)重程度

13、。
　　結(jié)果：
　　1測(cè)定并分析正常人和心衰病人外周血中Sema4D的含量
　　(1)可溶性Sema4D含量檢測(cè)的ELISA方法的建立
　　為了測(cè)定心衰病人Sema4D的表達(dá)，我們首先建立了夾心ELISA方法。我們首先擴(kuò)增了含有His標(biāo)簽標(biāo)記的 Sema4D的胞外段 pSecTag2B質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染罰轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，用親和層析法分離純化上清中的 Sema4D蛋白，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示其分子量在1

14、20kD作用，該蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。并以該蛋白作為抗原免疫小鼠，制備了10株單克隆抗體，從這10株單克隆抗體中篩選了兩株分別作為包被抗體和檢測(cè)抗體，檢測(cè)抗體標(biāo)記 HRP。并以該蛋白作為抗原免疫小鼠，制備了10株單克隆抗體，從中篩選兩株分別作為包被抗體和檢測(cè)抗體，檢測(cè)抗體標(biāo)記 HRP，建立夾心 ELISA方法。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立夾心 ELISA方法，并得到了很好的標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2=0.996）。
　　(2)心衰病人特別是合并糖尿病的心衰病

15、人血漿中 Sema4D水平顯著增加
　　我們收集了126位正常人的EDTA抗凝外周血，離心取血漿。通過ELISA方法測(cè)定可溶性 Sema4D的表達(dá)。結(jié)果顯示，不同年齡組 Sema4D表達(dá)沒有顯著差異，但正常男性(5.15±3.30 ng/mL，n=63)較正常女性(4.19±2.39 ng/mL，n=63，P<0.05)Sema4D表達(dá)顯著增加。此外，17β雌二醇能夠顯著抑制 Jurkat細(xì)胞表面Sema4D的表達(dá)（P<0.05）

16、，也能夠抑制Collagen誘導(dǎo)的血小板Sema4D切割。
　　心衰病人外周血Sema4D表達(dá)水平(8.94±5.89 ng/mL)顯著高于正常對(duì)照(4.67±2.99 ng/mL)(P<0.0001)。但不同心衰分級(jí)、年齡對(duì)Sema4D的表達(dá)沒有影響。男性心衰病人（9.26±6.35 ng/mL，n=88）較女性心衰病人（8.54±5.26 ng/mL，n=69)有增加的趨勢(shì)，但無顯著差異（P=0.19）。
　　合并糖尿病

17、(w/DM)的心衰病人(10.45±5.76 ng/mL，n=40)較未合并糖尿病的心衰病人（w/oDM）(8.42±5.87 ng/mL，n=117)Sema4D表達(dá)顯著增加。而是否合并高血壓(HP)對(duì)Sema4D的表達(dá)無顯著影響。
　　2心衰病人外周血T細(xì)胞和血小板表面Sema4D表達(dá)水平變化。
　　(1)心衰病人CD3+T細(xì)胞(P=0.002)，包括CD4+ T細(xì)胞(P=0.006)和CD8+T細(xì)胞(P=0.015)表

18、面Sema4D水平顯著升高，提示T細(xì)胞可能是心衰病人血漿中Sema4D增加的一個(gè)重要來源。
　　(2)心衰病人B細(xì)胞表面Sema4D表達(dá)水平?jīng)]有變化(P=0.46)，血小板表面Sema4D雖然有增加的趨勢(shì)，但無顯著差異(P=0.188)。
　　加的趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.15）。CD4+T細(xì)胞（P=0.29）、CD8+T（P=0.09）細(xì)胞百分比也無明顯變化，這可能與 Sema4D有活化 T細(xì)胞的作用有關(guān)。但是，F(xiàn)4/

19、80+巨噬細(xì)胞（P=0.0005）、CD11+M1型巨噬細(xì)胞（P=0.02）占 CD45+白細(xì)胞的百分比顯著增加。
　　4 Sema4D體外抑制脂肪分化
　　從脂肪組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞，傳到第三代后，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞 marker（CD90和 CD105）的表達(dá)。結(jié)果顯示分離的間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)白細(xì)胞的marker CD45，提示干細(xì)胞中沒有白細(xì)胞的污染，并且絕大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的marker CD9

20、0和CD105；隨后，我們將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞接種于六孔板，分別轉(zhuǎn)染對(duì)照和表達(dá) Sema4D細(xì)胞外段的質(zhì)粒，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后加入脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，第七天取細(xì)胞進(jìn)行油紅 O染色，檢測(cè)脂肪分化效率。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了Sema4D的細(xì)胞脂肪分化明顯降低。
　　5 PlexinB1敲除促進(jìn)高脂誘導(dǎo)的脂肪肝。
　　RT-PCR檢測(cè) PlexinB1在骨骼肌、內(nèi)臟脂肪、肝臟中的表達(dá)，已知表達(dá)PlexinB1的腎臟作為陽性對(duì)照，結(jié)果顯示內(nèi)臟脂肪和

21、肝臟均表達(dá) PlexinB1，但肝臟中PlexinB1表達(dá)量較高，高脂飲食誘導(dǎo)后小鼠肝臟中PlexinB1表達(dá)量明顯下降（P<0.01）。
　　剝離高脂飲食喂養(yǎng) WT和 PlexinB1-/-小鼠的生殖器脂肪和腎周脂肪，并拍照。與 Sema4D-/-類似，PlexinB1敲除也促進(jìn)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。同樣，油紅 O染色結(jié)果顯示 PlexinB1-/-小鼠脂肪肝顯著增加，realtime-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂代謝相關(guān)基因PPAR?1和P

22、PAR?2的表達(dá)也顯著上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.心衰病人特別是合并糖尿病的心衰病人外周血中可溶性Sema4D水平較正常人顯著增加，提示Sema4D可能成為心衰病人生物標(biāo)志之一。
　　2.心衰病人血漿中可溶性Sema4D含量增加與T細(xì)胞包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T表面Sema4D表達(dá)水平上調(diào)有關(guān)。
　　3. Sema4D敲除促進(jìn)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和脂肪肝。
　　4. Sema4對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和脂肪肝