組織工程軟骨在大動物體內(nèi)構(gòu)建穩(wěn)定性的研究.pdf

1、頭面部軟骨缺損是整形外科常見的疾病，采用組織工程技術(shù)修復(fù)頭面部軟骨缺損具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。然而，這項技術(shù)至今并未真正應(yīng)用于臨床，主要瓶頸在于工程化軟骨在具有完整免疫力的大動物體內(nèi)構(gòu)建穩(wěn)定性很低并無法長期存活。究其原因，構(gòu)建軟骨最常用的PGA/PLA支架材料在體內(nèi)快速降解引起的無菌性炎癥反應(yīng)是干擾大動物體內(nèi)軟骨再生的主要原因，并且這是一種以巨噬細胞參與為主的固有免疫反應(yīng)。因此，解決問題的關(guān)鍵在于如何有效地抵抗或避免這種以巨噬細胞參與為

2、主的固有免疫反應(yīng)。首先，大量文獻報道，骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)除具備基本的干性和低免疫原性外，還對機體多種免疫細胞具有免疫調(diào)節(jié)作用。那么，由BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨是否具有抑制以巨噬細胞介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)，從而改善其在大動物體內(nèi)的形成質(zhì)量需要進一步探索;此外，優(yōu)化體外構(gòu)建技術(shù)，通過延長體外培養(yǎng)時間促進PGA/PLA的降解，或單純應(yīng)用軟骨細胞的方式構(gòu)建軟骨以避免材

3、料引起的炎癥反應(yīng)，是否能有效改善工程化軟骨在大動物體內(nèi)的組織形成也需要進一步探索。
　　目的:
　　1.明確不同種子細胞及應(yīng)用方案在大動物皮下的構(gòu)建效果
　　2.明確基于BMSCs構(gòu)建的組織工程軟骨對巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)作用，并探討其相關(guān)機制。
　　3.明確PGA/PLA體外殘留量對工程化軟骨在大動物皮下軟骨形成的影響
　　4.明確應(yīng)用單純軟骨細胞膜片構(gòu)建的軟骨在大動物皮下的組織形成質(zhì)量
　　方法和結(jié)果

4、:
　　1.基于PGA/PLA的組織工程軟骨在大動物體內(nèi)構(gòu)建穩(wěn)定性的研究
　　1.1不同種子細胞構(gòu)建的組織工程軟骨在大動物體內(nèi)轉(zhuǎn)歸的研究
　　方法:將豬耳廓軟骨細胞、BMSCs以及兩者1∶1混合分別接種至PGA/PLA支架材料構(gòu)建工程化軟骨，體外培養(yǎng)8周后取材，首先進行組織學(xué)、生物學(xué)及生物力學(xué)檢測，并回植入豬自體皮下，規(guī)定時間內(nèi)取材，比較不同時期三者在豬自體皮下軟骨形成質(zhì)量及炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)果:豬耳廓軟骨細胞、

5、BMSCs以及1∶1混合復(fù)合PGA/PLA支架，體外培養(yǎng)8周后均能形成良好的軟骨組織，組織學(xué)、總膠原及楊氏模量方面無明顯差異。將三者植入豬自體皮下后2周， BMSCs組維持了完整的軟骨結(jié)構(gòu)，1∶1組和軟骨細胞組均遭到不同程度的破壞;體內(nèi)植入后8周，BMSCs組仍可見部分軟骨組織，1∶1和軟骨細胞組遭到嚴(yán)重破壞。
　　1.2 BMSCs構(gòu)建的組織工程軟骨對巨噬細胞極化作用的研究
　　方法:耳廓軟骨細胞、BMSCs以及1∶1混合

6、復(fù)合PGA/PLA支架，以單純PGA/PLA支架為對照，體外培養(yǎng)8周后植入豬自體皮下，定期取材，比較各組體內(nèi)多核異物巨細胞數(shù)量以及巨噬細胞CD68和CD206的表達。同時，將上述三組體外培養(yǎng)8周后的工程化軟骨與激活的巨噬細胞以transwell的方式共培養(yǎng)24小時，采用免疫熒光、Real time PCR、Elisa等方法檢測巨噬細胞免疫表型的改變。
　　結(jié)果:多核異物巨細胞和CD68陽性巨噬細胞在BMSCs組浸潤最少，PGA/P

7、LA支架組最高，1∶1和軟骨細胞組無明顯差異;M2型巨噬細胞特異表面標(biāo)志CD206在BMSCs組表達最高，PGA/PLA支架組最低。體外共培養(yǎng)模型進一步驗證BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨與巨噬細胞共培養(yǎng)后高表達CD206、IL-10、Arg-1等抗炎因子，低表達IL-1β和TNF-α等促炎因子，提示BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨具有促進巨噬細胞向M2型極化的作用。
　　1.3 PGA/PLA殘留量對工程化軟骨在大動物體內(nèi)軟骨形成的影響

8、r>　　方法:分別以軟骨細胞和BMSCs為種子細胞復(fù)合PGA/PLA，體外培養(yǎng)8周、12周、16周，比較體外培養(yǎng)不同時間點形成的工程化軟骨在組織學(xué)、生物學(xué)水平的差異，并計算體外PGA/PLA殘留量、殘留PGA直徑。對比體外培養(yǎng)不同時間點后植入豬自體皮下2周、8周所對應(yīng)的軟骨形成及炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)果:分別應(yīng)用軟骨細胞和BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨延長體外培養(yǎng)時間，可見PGA/PLA殘留量逐漸減少，殘留PGA直徑逐漸變細，植入豬自體皮

9、下后2周，體外12周和16周組軟骨形成均較體外8周組好，但在植入后8周，各組工程化軟骨均遭到破壞。不同培養(yǎng)時間的BMSCs組在植入后2周均維持了完整的軟骨形態(tài)，但體外12周和16周組在體內(nèi)軟骨形成厚度明顯大于8周組。
　　2.應(yīng)用單純軟骨細胞膜片在大動物體內(nèi)再生軟骨組織的研究
　　方法:將P3代豬耳廓軟骨細胞以超高密度“細胞堆積”的方法形成軟骨細胞膜片，體外培養(yǎng)12周，組織學(xué)檢測膜片形成質(zhì)量，并植入豬自體皮下，觀察植入后2周

10、、8周、24周再生軟骨的形成情況。
　　結(jié)果:軟骨細胞通過超高密度“細胞堆積”的方法可以在體外形成均質(zhì)的和具有一定厚度的軟骨細胞膜片，植入豬自體皮下后未見明顯炎癥反應(yīng)，軟骨細胞膜片逐漸成熟并能長期存活，體內(nèi)24周組織學(xué)結(jié)構(gòu)與正常軟骨組織相似。
　　結(jié)論:
　　1.單純耳廓軟骨細胞、BMSCs、以及耳廓軟骨細胞與BMSCs(1∶1)復(fù)合PGA/PLA支架材料在成軟骨誘導(dǎo)液作用下體外培養(yǎng)8周均能構(gòu)建出優(yōu)質(zhì)的軟骨組織，將三組

11、工程化軟骨植入豬自體皮下，僅BMSCs組在植入后2周維持了完整的軟骨結(jié)構(gòu)。
　　2.基于BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨具有促進M2型巨噬細胞極化從而抑制炎癥反應(yīng)，改善工程化軟骨在大動物皮下的組織形成質(zhì)量。同時，通過體外共培養(yǎng)模型進一步驗證BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨是通過促進CD206、IL-10、Arg-1等抗炎因子的合成，降低IL-1β和TNF-α等促炎因子的合成完成巨噬細胞M2型的極化。
　　3.工程化軟骨在體外培養(yǎng)至16周