ebv-miR-BART6-5p對EBV相關淋巴瘤細胞增殖和凋亡影響的研究.pdf

1、第一部分EBV miRNA在EBV相關淋巴瘤中的生物信息學分析
　　目的：挖掘Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫中潛在的與EBV相關淋巴瘤有關的EBV miRNA及其靶基因并進行驗證。方法：在GEO數(shù)據(jù)庫中根據(jù)納入標準篩選并下載EBV相關淋巴瘤的miRNA表達譜芯片數(shù)據(jù)集GSE52916和mRNA表達譜芯片數(shù)據(jù)集GSE38885，運用GEO2R在線分析工具進行差異表達EBV miRNA和mRNA篩選，利

2、用生物信息學相關軟件工具進行生物學功能注釋、通路富集、EBV miRNA-mRNA互作分析，對EBV miRNA在EBV相關淋巴瘤中的作用進行綜合評估。最后通過實時熒光定量PCR對篩選得到的EBV miRNA在EBV陽性細胞Raji、Daudi、Farage和EBV陰性細胞Ramos、Pfeiffer中進行驗證。結果：在GEO數(shù)據(jù)庫中獲得了符合納入標準的miRNA和mRNA表達譜芯片數(shù)據(jù)集各一組，篩選得到18個在EBV陽性淋巴瘤中表達上

3、調(diào)的EBV miRNA和38個既是生物信息學軟件預測出的EBV miRNA的靶基因也是在EBV陽性淋巴瘤中下調(diào)的mRNA；對預測出的18個EBV miRNA的靶基因富集獲得了Wnt信號通路、MAPK信號通路等多個與淋巴瘤發(fā)生和進展有關的信號通路；生物學功能注釋發(fā)現(xiàn)這些EBV miRNA的靶基因參與了淋巴細胞分化、轉錄調(diào)節(jié)等生物學過程；EBV miRNA-mRNA互作分析顯示篩選得到的18個EBV miRNA和38個mRNA中形成68對調(diào)

4、控關系，其中ebv-BART11-5p、ebv-BART14-3p、ebv-BART1-3p、ebv-BART6-5p、ebv-BART17-5p、ebv-BART11-3p六個EBV miRNA調(diào)控了68對中的37對，占54％。經(jīng)過實時熒光定量PCR對篩選出的EBV miRNA進行表達差異檢測，最終ebv-miR-BART1-5p、ebv-miR-BART1-3p、ebv-miR-BART5-5p、ebv-miR-BART6-5p、e

5、bv-miR-BART6-3p、ebv-miR-BART9、ebv-miR-BART14-3p、ebv-miR-BART15、ebv-miR-BART16、ebv-miR-BART17-5p、ebv-miR-BART17-3p這11個EBV miRNA經(jīng)驗證表達趨勢與芯片結果一致。結論：通過對芯片數(shù)據(jù)的挖掘，利用生物信息學軟件分析，可以獲得在EBV陽性淋巴瘤中表達上調(diào)的EBV miRNA及其潛在的靶基因，可有效指導下步分子生物學實驗。其

6、中ebv-miR-BART6-5p在EBV陽性和陰性細胞中的表達差異倍數(shù)較大，并且在EBV miRNA-mRNA網(wǎng)絡調(diào)控中處于重要位置，可進一步探討其生物學功能及作用機制。
　　第二部分 ebv-miR-BART6-5p對EBV相關淋巴瘤細胞增殖和凋亡影響的研究
　　目的：通過體外分子生物學實驗探討ebv-miR-BART6-5p對EBV相關淋巴瘤細胞增殖和凋亡的影響。方法：電穿孔法轉染ebv-miR-BART6-5p沉默和

7、過表達質粒構建表達下調(diào)和過表達的細胞模型；利用慢病毒表達載體構建穩(wěn)定下調(diào)ebv-miR-BART6-5p的EBV陽性淋巴瘤細胞模型，實時熒光定量PCR檢測ebv-miR-BART6-5p的表達水平；CCK8法測定細胞生長曲線；流式細胞術檢測細胞凋亡；Western Blot檢測轉染后細胞Akt、Bax、NF-κB p65、Iκκβ蛋白的表達量。結果：通過電穿孔法構建ebv-miR-BART6-5p表達下調(diào)細胞模型BART6-5p inh

8、ibitor/Farage和過表達細胞模型BART6-5p mimics/Pfeiffer，實時熒光定量PCR檢測ebv-miR-BART6-5p的表達量，BART6-5p inhibitor/Farage組低于miR-shNC/Farage組和Farage組，BART6-5p mimics/Pfeiffer組高于miR-shNC/Pfeiffer組和Pfeiffer組，P＜0.05；CCK8法檢測細胞生長曲線結果示BART6-5p i

9、nhibitor/Farage組細胞增殖力低于miR-shNC/Farage組和Farage組，P＜0.05，BART6-5p mimics/Pfeiffer組細胞增殖力低于Pfeiffer組細胞，P＜0.05，BART6-5p mimics/Pfeiffer組細胞增殖力與miR-shNC/Pfeiffer組細胞的差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.05；流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示BART6-5p inhibitor/Farage組細胞凋亡率

10、高于Farage組細胞，P＜0.05，BART6-5p inhibitor/Farage組細胞凋亡率高于miR-shNC/Farage組細胞，但差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.05，BART6-5p mimics/Pfeiffer組細胞凋亡率高于Pfeiffer組細胞，P＜0.05，BART6-5p mimics/Pfeiffer組細胞凋亡低于miR-shNC/Pfeiffer組細胞，差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。利用慢病毒載體成功構建了e

11、bv-miR-BART6-5p穩(wěn)定下調(diào)的GV-BART6-5p down/Farage細胞模型，實時熒光定量PCR檢測ebv-miR-BART6-5p的表達量明顯低于于未轉染的Farage細胞和轉染陰性對照病毒的NC/Farage細胞，P＜0.05；CCK8測細胞生長曲線結果顯示GV-BART6-5p down/Farage組細胞增殖能力明顯低于Farage和NC/Farage組細胞，差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05；流式細胞術檢測三組

12、細胞的凋亡率發(fā)現(xiàn)GV-BART6-5p down/Farage組細胞的凋亡率高于Farage和NC/Farage組細胞，差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05；Western Blot檢測GV-BART6-5p down/Farage組細胞中Akt、NF-κB p65、Iκκβ蛋白的表達量較Farage和NC/Farage組細胞下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05，Bax蛋白表達量較Farage組細胞上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05，

13、較NC/Farage組細胞表達量上調(diào)，但差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。結論：ebv-miR-BART6-5p有促進淋巴瘤細胞增殖，抑制細胞凋亡的可能，可以上調(diào)細胞PI3K/Akt、NF-κB信號通路的活性，抑制凋亡誘導蛋白Bax的表達。
　　第三部分 ebv-miR-BART6-5p的靶基因驗證
　　目的：前期體外生物學實驗發(fā)現(xiàn)改變EBV陽性淋巴瘤細胞Farage的ebv-miR-BART6-5p表達可以影響淋巴瘤細胞的增

14、殖和凋亡，本部分對ebv-miR-BART6-5p的靶基因及其結合位點進行驗證。方法：利用生物信息學方法預測靶基因，WesternBlot技術檢測GV-BART6-5p down/Farage、NC/Farage和Farage三組細胞中靶蛋白表達量，最后通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證靶基因的結合位點。結果：運用生物信息學軟件預測同時結合EBV miRNA-mRNA互作圖，選擇DICER1作為候選靶基因進行驗證。Western Blo