EBV相關(guān)淋巴瘤中病毒基因多態(tài)性的研究.pdf

1、目的：EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)在人群中感染非常普遍，參與多種人類腫瘤的發(fā)生，如Burkitt’s淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma,BL)、何杰金病(Hodgkin’s disease，HD)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)以及胃癌等，其中與淋巴瘤的密切相關(guān)性已被確認(rèn)。EBV相關(guān)腫瘤的分布具有明顯的地域性和人群傾向性，除環(huán)境因素和遺傳因素外，與EBV相關(guān)腫瘤有

2、關(guān)的EBV基因變異一直是倍受關(guān)注的熱點(diǎn)問題。中國(guó)是淋巴瘤的高發(fā)區(qū)，本研究選擇青島地區(qū)EBV陽(yáng)性淋巴瘤作為研究對(duì)象，對(duì)腫瘤組織中EBV分型和病毒基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)分析，探討我國(guó)非NPC高發(fā)區(qū)EBV陽(yáng)性淋巴瘤組織中EBV基因型的分布以及是否存在與淋巴瘤發(fā)生相關(guān)的EBV基因變異，通過比較同一人種NPC高發(fā)區(qū)和低發(fā)區(qū)EBV基因多態(tài)性以及同一地區(qū)不同腫瘤間EBV基因多態(tài)性，揭示EBV基因多態(tài)性與EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生的關(guān)系以及EBV相關(guān)腫瘤地域性分布

3、的原因。
　　方法：①收集青島地區(qū)354例石蠟包埋淋巴瘤標(biāo)本，采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)石蠟切片組織中EBV編碼小RNAl(EBV-encoded smallRNA1，EBERl)的轉(zhuǎn)錄以篩選EBV陽(yáng)性淋巴瘤標(biāo)本。②采用PCR、PCR-RFLP、巢式PCR及DNA測(cè)序等技術(shù)檢測(cè)分析EBV陽(yáng)性ENKTL標(biāo)本中病毒1/2分型、C/D分型、F/f分型及LMP130bp缺失變異，并與當(dāng)?shù)豊PC、EBVaGC和健康人群中EBV基因型的分布比較分析

4、，免疫組化檢測(cè)ENKTL(Extranodal NK/T-cell lymphoma,nasal type,ENKTL)組織中LMP1表達(dá)情況。③巢式PCR結(jié)合DNA測(cè)序檢測(cè)EBV陽(yáng)性淋巴瘤和NK/T細(xì)胞淋巴瘤標(biāo)本中EBV即刻早期基因BZLF1、BRLF1和早期基因BARF1、BHRF1多態(tài)性，應(yīng)用DNA Star軟件對(duì)序列進(jìn)行對(duì)比分析。與EBV標(biāo)準(zhǔn)株B95-8序列比較；根據(jù)各基因出現(xiàn)的突變情況進(jìn)行分類分型，分析基因突變對(duì)相關(guān)基因功能的

5、影響，同時(shí)與已發(fā)表文獻(xiàn)中EBV基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果比對(duì)分析。
　　結(jié)果：①354例淋巴瘤標(biāo)本中霍奇金淋巴瘤、成熟B細(xì)胞淋巴瘤、成熟NK/T細(xì)胞淋巴瘤以及前體淋巴腫瘤的EBV陽(yáng)性檢出率分別為39.1％(9/23)，1.44%(3/209)，69.4%(75/108)，0%(0/14)，共篩選出87例EBV陽(yáng)性淋巴瘤標(biāo)本，其中ENKTL標(biāo)本67例。
　　②EBV陽(yáng)性ENKTL組織中1、C、F型EBV的檢出率分別為80.4%(45/

6、56），66.1%(37/56）和87.5%(49/56），EBV陽(yáng)性ENKTL中3種型別的分布與當(dāng)?shù)豊PC和健康人群中的分布一致(χ2=2.939/5.626,P=0.060/0.230)，但與EBVaGC組織中C/D分型的分布差異顯著(χ2=9.522,P=0.009)。
　?、跮MP1C端成功擴(kuò)增的48例ENKTL中有40例為Del-LMP1，占83.3%，8例為未缺失野生型LMP1。免疫組化檢測(cè)62例ENKTL組織中LMP

7、1表達(dá)，陽(yáng)性率為59.7%(37/62)。LMP1表達(dá)與ENKTL發(fā)病部位相關(guān)(χ2=5.421,P=0.020)，但與年齡和性別分布等病理參數(shù)無(wú)相關(guān)性(χ2=1.698/0.193,P=0.193/0.360)。
　?、?1例EBV陽(yáng)性淋巴瘤標(biāo)本中有26例BZLF1基因測(cè)序成功，檢測(cè)到BZLF1-A、BZLF1-B和BZLF1-C3種BZLF1基因型，所占比例分別為34.6%、57.7%和3.8%，另有1例未歸類標(biāo)本；這包括BZ

8、LF1-A1、BZLF1-A2、BZLF1-B2、BZLF1-B3、BZLF1-B4和BZLF1-C6個(gè)亞型和1例“其他”亞型，比例分別為30.8%、3.8%、15.4%、3.8%、38.5%、3.8%和3.8%。所有BZLF1-B變異型均出現(xiàn)AA127位點(diǎn)的缺失突變，且在淋巴瘤中的分布顯著高于其在EBVaGC、NPC和健康人TWs的分布(P<0.05)。BZLF1功能區(qū)中，反式激活區(qū)發(fā)生的突變最多，其次為bZIP區(qū)，BRLF1協(xié)同作用

9、區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變。
　　⑤71例EBV陽(yáng)性淋巴瘤標(biāo)本中有33例BRLF1基因測(cè)序成功，與B95-8標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，共發(fā)現(xiàn)19處錯(cuò)義突變和20處沉默突變。33例淋巴瘤標(biāo)本中檢測(cè)到BR1-A、BR1-C和BR1-E3個(gè)變異型，檢出率分別為69.7%、27.3%和3%。與以往研究結(jié)果綜合分析，發(fā)現(xiàn)EBV陽(yáng)性淋巴瘤中BR1-C變異型的分布顯著高于其在健康人TWs標(biāo)本中的分布(P<0.05)，但與其在EBVaGC和NPC中的分布比較差異無(wú)顯著性(

10、P>0.05)。在BRLF1基因編碼產(chǎn)物Rta蛋白功能區(qū)中，二聚體區(qū)域高度保守，DNA結(jié)合區(qū)域和反式激活區(qū)域均檢測(cè)出序列變異；Rta蛋白16種CTL抗原表位中，只有NAA、QKE和ERP表位發(fā)生改變，且NAA和QKE在健康人群中突變率較高。
　?、?7例EBV陽(yáng)性NK/T細(xì)胞淋巴瘤標(biāo)本BARF1基因測(cè)序成功，與B95-8原型株比較，大部分NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中BARF1基因序列未發(fā)生突變。34例標(biāo)本BARF1核苷酸序列與B95-

11、8原型株相同(72.3%，34/47)，38例標(biāo)本(80.9%，38/47)BARF1編碼產(chǎn)物與B95-8有相同的氨基酸序列。共發(fā)現(xiàn)BARF1基因7處錯(cuò)義突變和12處沉默突變，根據(jù)位于BARF1轉(zhuǎn)化必需區(qū)域AA29V→A突變將BARF1變異型分為V29A，B95-8和“其他”3型。NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中各亞型的分布與其在EBVaGC(χ2=5.07，P>0.05)、NPC(χ2=4.77，P>0.05)和TWs(χ2=1.32，P>0

12、.05)的分布無(wú)顯著性差異。
　?、?3例EBV陽(yáng)性NK/T細(xì)胞淋巴瘤標(biāo)本BHRF1基因測(cè)序成功，有51例(51/53,96.2%)標(biāo)本檢測(cè)到突變，共檢測(cè)到11個(gè)位點(diǎn)的錯(cuò)義突變(AA14Ile→Val,24Thr→Ser,33Ala→Pro,63Glu→Lys,75His→Tyr,79Val→Leu/Met,88Leu→Val,101Ala→Thr,125Val→Ile,156Asp→Asn,157Asn→Thr)和3個(gè)位點(diǎn)的沉默

13、突變(54586nt a→c,54615nt t→c和54711nt c→t)，其中沉默突變54615nt t→c幾乎出現(xiàn)于所有標(biāo)本(85%,34/40)。AA88Leu→Val變異見于大部分標(biāo)本(77.4%，41/53)，AA79Val→Leu/Met變異出現(xiàn)頻率也較高。根據(jù)AA88L→V和AA79V→L突變出現(xiàn)與否，分為79V88V、79L88L和79V88L3種變異型。各亞型在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的分布與其在TWs(χ2=4.80

14、，P＞0.05)、EBVaGC(χ2=0.94，P＞0.05)和NPC(χ2=1.20，P>0.05)中的分布無(wú)顯著性差異。除3例淋巴瘤標(biāo)本在BHRF1基因Bcl-2同源區(qū)發(fā)生突變，其余標(biāo)本均未發(fā)生突變。
　　結(jié)論：①EBV感染與淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。青島地區(qū)EBV陽(yáng)性ENKTL中1型、C型和F型EBV較為常見，以1CF連鎖基因型為主。3種基因型綜合分析發(fā)現(xiàn)，各基因型分布與當(dāng)?shù)豊PC患者和健康人群EBV基因型的分布一致，C/D基因

15、型在EBVaGC組織中的分布與其在EBV陽(yáng)性淋巴瘤、NPC以及健康人群TWs中的分布有顯著性差異，表明EBV基因型變異以地域局限性為主，兼有疾病相關(guān)性。
　　②Del-LMP1是青島地區(qū)EBV陽(yáng)性ENKTL中的主要LMP1變異型，說(shuō)明LMP1C端缺失可能與ENKTL的發(fā)生密切相關(guān)。
　?、跡NKTL組織中LMP1蛋白有較高的表達(dá)率，LMP1是參與ENKTL發(fā)生的重要致癌因子。
　?、蹷ZLF1-A和BZLF1-B是青島

16、地區(qū)淋巴瘤中EBV的主要BZLF1基因型。BZLF1-A類型更多見于健康個(gè)體，具有AA127位點(diǎn)缺失突變的BZLF1-B基因型可能與淋巴瘤關(guān)系更密切。發(fā)生在ZEBRA蛋白反式激活區(qū)和bZIP區(qū)的突變可能對(duì)其功能產(chǎn)生影響。
　　⑤BR1-A和BR1-C是EBV陽(yáng)性淋巴瘤組織中EBV的主要BRLF1基因型，BR1-C可能與鼻咽癌和淋巴瘤的發(fā)生有關(guān)。發(fā)生在Rta蛋白DNA結(jié)合區(qū)域和反式激活區(qū)域的突變可能對(duì)其功能產(chǎn)生影響；多數(shù)CTL表位序