MAPK-ERK在上皮性卵巢癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:檢測(cè)p-ERK在卵巢癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，并使用MEK1/2抑制劑AZD6244作用于卵巢癌細(xì)胞，觀察其對(duì)卵巢癌細(xì)胞中p-ERK蛋白的表達(dá)，及對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，以探討MAPK/ERK信號(hào)通路在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及意義。
　　方法:(1)蛋白印跡法檢測(cè)各種卵巢癌細(xì)胞中p-ERK蛋白的表達(dá)，并檢測(cè)MEK抑制劑AZD6244對(duì)卵巢癌細(xì)胞p-ERK、ERK、PARP、CyclinD1、Caspase-3、Dy

2、rk1B蛋白表達(dá)的影響;(2)MTT比色法檢測(cè)AZD6244對(duì)OVCAR5、OVCAR8、A2780S和SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響;(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AZD6244對(duì)OVCAR5、OVCAR8、A2780S和SKOV3細(xì)胞凋亡和周期的影響;(4)免疫組化法檢測(cè)p-ERK蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)卵巢癌細(xì)胞中p-ERK蛋白表達(dá)情況:SKOV3、OV2008、C13、A2780S、A2780CP、OVCAR4、O

3、VCAR5、OVCAR8和CAOV3細(xì)胞普遍表達(dá)p-ERK蛋白。在OVCAR5、OVCAR8、A2780S和SKOV3四種細(xì)胞系中加入MEK抑制劑AZD6244(5、10μM)后均可抑制p-ERK蛋白的表達(dá)，且呈濃度依賴性，而ERK無(wú)明顯變化;同時(shí)，在OVCAR5、OVCAR8和A2780S中又發(fā)現(xiàn)AZD6244可誘發(fā)Caspase-3下調(diào)，并伴隨著CyclinD1和Dyrk1B的降低，且在OVCAR5中PARP出現(xiàn)了明顯的呈濃度依賴性

4、裂解片段(89KD);而在SKOV3中未發(fā)現(xiàn)AZD6244引起上述三種蛋白PARP、Caspase-3和CyclinD1的改變，反而出現(xiàn)了Dyrk1B蛋白表達(dá)的上調(diào)。(2)AZD6244作用于卵巢癌細(xì)胞后生存率的比較:MTT比色法顯示，不同濃度(0、2.5、5、10、25、50、100μM) MEK抑制劑AZD6244干預(yù)OVCAR5、 OVCAR8、A2780S和SKOV3細(xì)胞48h后，OVCAR5、OVCAR8、A2780S三種細(xì)胞

5、表現(xiàn)出不同程度的抑制，且抑制作用具有濃度依賴性，各實(shí)驗(yàn)加藥組生存率均低于對(duì)照組(0μM)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而在SKOV3細(xì)胞中，使用不同濃度的AZD6244作用48h后，細(xì)胞的增殖抑制作用不明顯;OVCAR5、OVCAR8、A2780S和SKOV3四種細(xì)胞系的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為3.88μM、12.99μM、39.06μM和＞100μM。(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在OVCAR5、OVCAR8和A2780S三種細(xì)胞系

6、中分別用AZD6244(5、10μM)處理48小時(shí)后細(xì)胞凋亡率明顯增加，隨著抑制劑濃度增加，細(xì)胞凋亡率隨之升高，與空白對(duì)照組(0μM)相比P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而在SKOV3細(xì)胞系中隨著抑制劑藥物濃度的增加凋亡率無(wú)明顯增加，P＞0.05差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞周期檢測(cè)在OVCAR5和OVCAR8兩種細(xì)胞系中實(shí)驗(yàn)組(AZD6244:5、10μM) G0/G1期比例較對(duì)照組(0μM)明顯增多，出現(xiàn)了G0/G1期阻滯，S期細(xì)胞比例減

7、少，呈濃度依賴關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，雖然在A2780S細(xì)胞中僅AZD624410μM組與對(duì)照組(0μM)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組G2/M期差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;然而在SKOV3細(xì)胞中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，各期細(xì)胞周期比例變化較小，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。(4)免疫組化檢測(cè)在104例卵巢癌臨床標(biāo)本中p-ERK的表達(dá)情況，包括早期（Ⅰ和Ⅱ期）56例，晚期（Ⅲ和Ⅳ期）48例，其中8例為低級(jí)別漿液性癌（low grad

8、e serous carcinoma，LGSC）、55例高級(jí)別漿液性癌（high grade serous carcinoma，HGSC）、10例透明細(xì)胞癌、15例卵巢子宮內(nèi)膜樣癌、16例粘液性癌;結(jié)果發(fā)現(xiàn)p-ERK1/2在LGSC的表達(dá)顯著高于HGSC(p＜0.05);與LGSC相比，透明細(xì)胞癌組織中的p-ERK1/2表達(dá)與LGSC的表達(dá)相仿，呈高水平表達(dá)(p＞0.05)，而粘液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌組織中的p-ERK1/2表達(dá)均較低(p

9、＜0.05);同時(shí)發(fā)現(xiàn)p-ERK陽(yáng)性率的表達(dá)與患者的年齡、臨床期別、術(shù)前CA125值等均無(wú)相關(guān)性，P＞0.05。
　　結(jié)論:本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p-ERK1/2在上皮性卵巢癌組織和細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá);MEK抑制劑AZD6244在下調(diào)卵巢癌細(xì)胞p-ERK表達(dá)的同時(shí)，可不同程度的抑制各細(xì)胞系的細(xì)胞增殖，誘發(fā)細(xì)胞凋亡和G0/G1期周期阻滯，伴隨著細(xì)胞凋亡蛋白PARP和Caspase-3以及周期調(diào)節(jié)蛋白CyclinD1的改變。綜上提示