從腸道菌群及腸道通透性角度探討黃芩苷抗代謝性炎癥的機(jī)制.pdf

1、目的:
　　近年來經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅速，人們生活水平大幅提高，但生活壓力的逐漸變大、久坐不動(dòng)的生活習(xí)慣、不良的飲食結(jié)構(gòu)，這些因素導(dǎo)致高脂血癥的發(fā)病率不斷增高。攝入營養(yǎng)物以及代謝過剩往往會(huì)引起人體內(nèi)炎癥因子及內(nèi)毒素(lipopolysaccharides，LPS)水平升高，從而形成代謝性炎癥（metaflammation），代謝性炎癥在高脂血癥的形成、發(fā)展及其并發(fā)癥的產(chǎn)生過程中起著重要的影響。代謝性炎癥發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜，主要有兩個(gè)重要的影響因

2、素。一個(gè)是腸道菌群的結(jié)構(gòu)及比例改變，革蘭陰性菌數(shù)量增加，導(dǎo)致LPS的大量產(chǎn)生;另一個(gè)則是機(jī)體內(nèi)LPS含量增加導(dǎo)致腸粘膜屏障被破壞，腸道通透性增加，導(dǎo)致LPS更多地通過腸粘膜進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，從而形成惡性循環(huán)。黃芩苷(baicalin)是從具有清熱解毒燥濕的中藥黃芩中提取的單體，具有多方面的藥理作用，特別在治療腸道疾病以及抗炎方面具有良好的療效。本課題組前期研究中的體外實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平證明:黃芩苷能夠促進(jìn)LPS誘導(dǎo)后IEC-6細(xì)胞的ZO-1mR

3、NA基因及蛋白的表達(dá)，對(duì)于腸粘膜機(jī)械屏障有一定的保護(hù)作用。本研究主要是通過建立高脂血癥小鼠模型從動(dòng)物水平探討黃芩苷(baicalin)(1)是否具有抗代謝性炎癥作用;(2)其是否會(huì)對(duì)高脂血癥小鼠緊密連接蛋白翻譯、表達(dá)及相應(yīng)的MicroRNA表達(dá)產(chǎn)生影響;(3)其對(duì)高脂血癥小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及豐度是否會(huì)有影響。
　　方法:
　　選取32只C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)平均分為正常組、模型組、黃芩苷高劑量組（劑量為50mg·kg-1

4、·d-1）、黃芩苷低劑量組（劑量為25mg·kg-1·d-1）。小鼠經(jīng)過l周適應(yīng)性喂養(yǎng)后開始實(shí)驗(yàn)。正常組及其他三組分別飼喂普通飼料和高脂飼料共8周，當(dāng)進(jìn)行到第4周時(shí)，2個(gè)黃芩苷用藥組每日定時(shí)分別給予相應(yīng)濃度黃芩苷灌胃5周，其余2組也同步給予生理鹽水灌胃0.5mL/d/只，實(shí)驗(yàn)過程中記錄各組小鼠體質(zhì)量、生活情況、健康狀況。實(shí)驗(yàn)第9周麻醉處死各組小鼠，收集各組小鼠血清、糞便以及腸組織。檢測各組小鼠血清血脂水平;運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA

5、)測定小鼠血清腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)及LPS水平;采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)法檢測黃芩苷對(duì)小鼠腸組織中Occludin、ZO-1的mRNA以及microRNA212、microRNA122基因表達(dá)的影響;采用蛋白免疫印跡法(Westernblot)檢測黃芩苷對(duì)小鼠腸緊密連接蛋白Occludin及ZO-1表達(dá)的影響;運(yùn)用Miseq平臺(tái)對(duì)小鼠腸道糞便微生物進(jìn)行基因測序。
　　結(jié)果:

6、>　　1.在實(shí)驗(yàn)剛開始時(shí)以及在經(jīng)過3周高脂飲食尚未經(jīng)過藥物干預(yù)時(shí)，各組小鼠體質(zhì)量無顯著性差異(P＞0.05)，在實(shí)驗(yàn)第八周治療結(jié)束后，與正常組相比，模型組小鼠體質(zhì)量明顯較大(P＜0.05)。
　　2.與正常組比較，模型組小鼠血清低密度脂蛋白(LDL)及總膽固醇(TC)水平顯著升高（P＜0.01），高密度脂蛋白(HDL)水平顯著降低（P＜0.01）;而經(jīng)過不同劑量的黃芩苷的干預(yù)后，黃芩苷高、低劑量組與模型組各血脂水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、意義(P＞0.05)。
　　3.模型組血清IL-6、TNF-α、內(nèi)毒素水平較正常組均顯著升高（P＜0.01）;與模型組比較，黃芩苷高劑量組血清IL-6、TNF-α、內(nèi)毒素水平顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，黃芩苷低劑量組內(nèi)毒素水平顯著降低(P＜0.01)。
　　4.與正常組比較，模型組的ZO-1及OccludinmRNA表達(dá)明顯減少（P＜0.05）;與模型組相比，黃芩苷高、低劑量組的ZO-1以及OccludinmRN

8、A表達(dá)均無顯著性變化（P＞0.05）。
　　5.與正常組比較，模型組的microRNA122及microRNA212表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。與模型組相比，黃芩苷高、低劑量組的microRNA122及microRNA212表達(dá)也無顯著差異（P＞0.05）。
　　6.模型組與正常組ZO-1及Occludin蛋白表達(dá)量無明顯差異（P＞0.05）。與模型組相比，黃芩苷高、低劑量組的ZO-1及Occludin蛋白表達(dá)量也無顯著

9、差異(P＞0.05)。
　　7.腸道菌群基因測序結(jié)果
　　(1)多樣性分析中:OTUs數(shù)目的比較，模型組較正常組升高(P＜0.05)，黃芩苷高劑量組比模型組明顯降低(P＜0.05);Shannon指數(shù)比較，模型組比正常組低(P＜0.05)，黃芩苷低劑量組比模型組高(P＜0.05)。ACE與Chao1指數(shù)比較，模型組比正常組的菌群物種總數(shù)大，2個(gè)用藥組與模型組無明顯差異。Coverage指數(shù)正常組、模型組、黃芩苷高劑量組數(shù)值均

10、在0.9以上.
　　(2)門水平豐度比較，模型組脫鐵桿菌門(Deferribacteres)和變形桿菌門(Proteobacteria)數(shù)目較正常組增多，疣微菌門(Verrucomicrobia)數(shù)目較正常組減少。屬水平豐度比較，模型組Christensenella、uncultured_Peptococcaceae、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)數(shù)目明顯較正常組升高，糞球菌屬(Coprococcus)、Akkerman

11、sia及uncultured_Lachnospiraceae較正常組減少;黃芩苷高劑量組及黃芩苷低劑量組脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)豐度均較模型組降低。各組的革蘭陰性菌與革蘭陽性菌之比(P)進(jìn)行比較，模型組明顯高于正常組(P＜0.05)，黃芩苷低劑量組顯著低于模型組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.黃芩苷不能降低高脂模型小鼠的血脂水平，能降低血清炎癥因子IL-6、TNF-α以及內(nèi)毒素的水平，對(duì)代謝性炎癥有治

12、療作用。
　　2.8周的高脂飲食能導(dǎo)致腸ZO-1及OccludinmRNA表達(dá)減少，但黃芩苷的干預(yù)并不能對(duì)此起到影響作用。
　　3.8周的高脂飲食以及黃芩苷的干預(yù)對(duì)腸microRNA122及microRNA212基因表達(dá)沒有明顯影響。
　　4.高脂飲食會(huì)導(dǎo)致小鼠腸道Christensenella、uncultured_Peptococcaceae、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)增多，糞球菌屬(Coprococ