腦卒中與腸道菌群及其代謝產(chǎn)物TMAO相關(guān)性的初步研究.pdf

1、腸道菌群及其代謝產(chǎn)物TMAO是動(dòng)脈粥樣硬化性疾病潛在的一個(gè)新的預(yù)防和治療靶點(diǎn)。然而，迄今為止，國內(nèi)還罕見關(guān)于大動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性腦卒中/短暫性腦缺血發(fā)作(LAA/TIA)患者腸道菌群及血漿TMAO水平改變的研究。
　　目的：
　　為了研究LAA/TIA與腸道菌群及血漿TMAO水平間的相關(guān)關(guān)系，我們建立了一個(gè)病例對(duì)照研究。本研究擬分析LAA/TIA患者腸道菌群改變情況，初步了解腸道菌群與卒中事件的相關(guān)性;比較卒中患者與正常對(duì)

2、照的血漿TMAO水平差異，揭示血漿TMAO水平與腸道菌群可能存在的相關(guān)關(guān)系，并為將來的進(jìn)一步研究建立理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　本病例對(duì)照研究連續(xù)納入了從2014年2月至2015年2月入住南方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的急性腦卒中/TIA患者。初步納入的患者將根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格篩選合格病例，最終診斷為急性缺血性腦卒中，且TOAST分型為L(zhǎng)AA的患者將進(jìn)入后續(xù)分析;而最終診斷為TIA，且有明確顱內(nèi)外動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的患者也將納

3、入后續(xù)分析。結(jié)合各項(xiàng)臨床數(shù)據(jù)證實(shí)與AS無關(guān)的缺血性腦卒中（如心源性等）和無明顯顱內(nèi)外AS斑塊證據(jù)的TIA患者將被剔除。對(duì)照組參與者來源于在南方醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的人群，對(duì)照組人群均已完善頸動(dòng)脈彩超(CDFI)、經(jīng)顱彩色多普勒(TCD)和超聲心動(dòng)圖(UCG)等檢查。所有患者均采集了入院后的首個(gè)空腹血液樣本（使用EDTA抗凝采血管）及入院48小時(shí)內(nèi)的首個(gè)糞便樣本。對(duì)照組人群收集其體檢當(dāng)天的空腹血樣及糞便樣本。所有血液樣本收集后，在低溫下運(yùn)送至

4、實(shí)驗(yàn)室，然后在4℃，3000轉(zhuǎn)/分鐘下低溫離心10分鐘，隨后抽取上清（血漿）凍存于-80℃。所有新鮮采集的糞便樣本將及時(shí)凍存于-80℃，直至進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　糞便樣本總DNA（腸道菌群總DNA）將嚴(yán)格根據(jù)說明書使用MOBIO強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒(MOBIO)進(jìn)行提取。所獲得的DNA產(chǎn)物及時(shí)凍存于-20℃以備后期進(jìn)行PCR擴(kuò)增使用。在獲得腸道菌群總DNA產(chǎn)物后，我們以16s rRNA V4可變區(qū)域帶barcode的通用引物進(jìn)行

5、PCR擴(kuò)增，本研究所用上游引物是514F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)，下游引物是805R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。在獲得PCR產(chǎn)物后，我們將抽取少量產(chǎn)物進(jìn)行跑膠以確定獲得目標(biāo)條帶（提示DNA擴(kuò)增成功）。最終，所有的PCR產(chǎn)物經(jīng)定量混合后，統(tǒng)一送至華大基因公司（深圳，中國）進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序方法采用Illumina Miseq(PE150)測(cè)序技術(shù)。在測(cè)序前原始序列將利用BIPES技術(shù)進(jìn)行預(yù)處理。
　　

6、在獲得腸道菌群總DNA測(cè)序結(jié)果后，我們使用QIIME(1.8.0)進(jìn)行了腸道菌群的基礎(chǔ)分析。利用Usearch算法(Usearch algorithm)所有的序列被歸類為OTUs。OTU（Operational Taxonomic Units，分類操作單元）是人為的在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，給某一個(gè)分類單元（品系，種，屬，分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。在生物學(xué)信息分析中，一般來說，測(cè)序得到的每一條序列來自一個(gè)菌。要

7、了解一個(gè)樣品測(cè)序結(jié)果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息，就需要對(duì)序列進(jìn)行歸類操作(cluster)。通過歸類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個(gè)小組就是一個(gè)OTU，或者說一個(gè)OTU代表一種細(xì)菌。通常在97％的相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)OTU的代表性序列根據(jù)序列的頻率進(jìn)行確定;代表序列利用PyNAST算法(PyNASTalgorithms)進(jìn)行校準(zhǔn)排齊處理;將去除嵌合體后的OTU中的代表序列插入FastTree軟件中，

8、以生成所有OTU代表序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行α-和β-多樣性分析。根據(jù)OTU數(shù)據(jù)的特點(diǎn)，隨機(jī)森林分類模型利用R軟件包來分類來自患者和健康對(duì)照的樣本。為了確定LAA/TIA患者和對(duì)照組具有顯著差異的細(xì)菌類群，我們?cè)趦山M間進(jìn)行了LEfSe(linear discriminate analysissize effect)分析以比較兩組間的菌群差異。在本次分析中，我們將LDA(lineardiscriminate analysis

9、，線性判別分析)臨界值設(shè)置為3。
　　在進(jìn)行TMAO檢測(cè)前，所有血漿樣本均保持在-80℃環(huán)境下凍存。血漿TMAO測(cè)定采用克利夫蘭醫(yī)學(xué)中心研究人員建立的穩(wěn)定同位素稀釋液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)(6，460 Series Triple Quadrupole LC/MS，Agilent，USA)進(jìn)行定量檢測(cè)。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用R(3.0.2)完成。在本研究中，各項(xiàng)納入研究指標(biāo)均因未能同時(shí)符合Shapiro-Wilk正態(tài)性

10、檢驗(yàn)和Bartlett方差齊性檢驗(yàn)，故我們采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Wilcoxon秩和檢驗(yàn)方法或Kruskal Wallis秩和檢驗(yàn)方法）來對(duì)兩組及多組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，成對(duì)樣本則用Nemenyi檢驗(yàn)法。分類變量采用卡方檢驗(yàn)。由于微生物組數(shù)據(jù)的多維性，我們?cè)赒IIME1.8.0平臺(tái)上進(jìn)行微生物組的Adonis檢驗(yàn)。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　在本研究中，最終共有435名急性缺血性腦卒中/TIA患者被初步納入研

11、究，經(jīng)過后期的篩選（嚴(yán)格執(zhí)行納入及排除標(biāo)準(zhǔn)），最終有322名LAA/TIA患者符合納入標(biāo)準(zhǔn)。所有322名患者均采集了入院后首個(gè)空腹血漿樣本，其中141名患者在入院48小時(shí)內(nèi)留取了合格的糞便樣本。對(duì)照組最終納入了符合入組條件的231名體檢者，其中97名對(duì)照組人員于體檢當(dāng)天留取了合格的新鮮糞便樣本。
　　首先，我們根據(jù)對(duì)照組頸動(dòng)脈彩超結(jié)果是否存在AS改變將對(duì)照組分為3個(gè)亞組:明確存在頸AS斑塊形成組（AS亞組）、頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(i

12、ntima-media thickness)增加組（IMT亞組）及未發(fā)現(xiàn)明顯AS改變組(Non-AS亞組)。我們分析比較了對(duì)照組三個(gè)亞組間的血漿TMAO水平及腸道菌群，結(jié)果表明，三組間血漿TMAO水平及腸道菌群均未見顯著性差異。上述分析結(jié)果說明，在正常對(duì)照組中，AS與腸道菌群結(jié)構(gòu)和血漿TMAO水平均未見明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)關(guān)系。
　　然而，無論是利用傳統(tǒng)的PCoA（principal coordinate analysis，主坐標(biāo)分析

13、）分析法，還是基于隨機(jī)森林算法的機(jī)器學(xué)習(xí)分析法，LAA/TIA患者組（疾病組）的腸道菌群結(jié)構(gòu)則表現(xiàn)出了明顯不同于對(duì)照組的腸道菌群結(jié)構(gòu)。其中，α-多樣性分析表明疾病組具有較對(duì)照組明顯多樣化的腸道菌群?；谖醇訖?quán)的UniFrac距離分析，我們發(fā)現(xiàn)相比于Non-AS和IMT組，對(duì)照組AS亞組的腸道菌群結(jié)構(gòu)已經(jīng)表現(xiàn)出了傾向于類似LAA/TIA患者腸道菌群失衡改變的趨勢(shì)。這個(gè)結(jié)果說明，對(duì)照組AS亞組的腸道菌群結(jié)構(gòu)已經(jīng)出現(xiàn)了輕度的紊亂表現(xiàn)，且這種紊

14、亂與疾病組相似。另外，LEfSe分析表明，疾病組患者腸道菌群含有更多的機(jī)會(huì)致病菌（有害菌），如腸桿菌屬、巨型球菌屬、脫硫弧菌屬等，而被廣泛認(rèn)可的有益菌如擬桿菌屬、普氏菌屬和柔嫩梭菌屬含量明顯下降。且這種菌群紊亂的改變?cè)谧渲休^為嚴(yán)重的患者中更加明顯。
　　與此同時(shí)，通過檢測(cè)兩組人群的血漿TMAO水平，我們發(fā)現(xiàn)，與預(yù)期的結(jié)果相反，LAA/TIA患者血漿TMAO水平非但沒有出現(xiàn)升高，反而出現(xiàn)了較對(duì)照組顯著下降的現(xiàn)象(P＜0.05)。