線粒體tRNATrp5512A-G突變與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　1.通過(guò)對(duì)細(xì)胞功能水平層面研究線粒體tRNATrp5512A＞G突變與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.調(diào)查和收集攜帶線粒體tRNATrp5512A＞G突變的家系的臨床資料，繪制家系圖，從遺傳角度對(duì)患者家系進(jìn)行分析。
　　2.應(yīng)用生物學(xué)分析軟件CodonCode Aligner對(duì)先證者線粒體全序與修訂的劍橋標(biāo)準(zhǔn)參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，應(yīng)用生物學(xué)分析軟件Clustal X對(duì)17種靈長(zhǎng)類物種線粒體

2、tRNATrp5512位點(diǎn)進(jìn)行保守性分析。
　　3.采集先證者及其他母系成員和正常對(duì)照外周血，分離淋巴細(xì)胞，利用EB病毒構(gòu)建攜帶線粒體tRNATrp5512A＞G突變和正常對(duì)照永生化淋巴母細(xì)胞系(lymphoblastoid cell lines, LCLs)。
　　4.在分子水平上運(yùn)用Northern Blot雜交技術(shù)對(duì)線粒體tRNA穩(wěn)態(tài)水平進(jìn)行分析、運(yùn)用Western Blot技術(shù)分析線粒體編碼蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　

3、　5.從永生化淋巴母細(xì)胞系活性氧水平以及細(xì)胞氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的能力幾個(gè)方面分析攜帶線粒體tRNATrp5512A＞G突變對(duì)永生化類淋巴母細(xì)胞系整體功能的影響。
　　結(jié)果：
　　1.家系中母系成員5人，其中高血壓患者2人，分別為先證者及其女兒，發(fā)病年齡分別為81歲和62歲，平均發(fā)病年齡71歲。
　　2.對(duì)先證者線粒體全序列分析發(fā)現(xiàn)除了攜帶tRNATrp5512A＞G突變外，還存在26個(gè)不同于修訂的劍橋標(biāo)準(zhǔn)參考序列的突

4、變。先證者線粒體單體型分析，先證者屬于東亞單體型A。線粒體tRNATrp5512位點(diǎn)在17種靈長(zhǎng)類物種中保守性高，保守指數(shù)為100％。
　　3.攜帶線粒體tRNATrp5512A＞G突變的永生化淋巴細(xì)胞系線粒體tRNA~平均穩(wěn)態(tài)水平是對(duì)照組的24.2％(P=0.0120)，線粒體tRNAAla，tRNALeu(CUN)，tRNAIle，tRNALeu(UUR)和tRNASer(UCN)的穩(wěn)態(tài)水平分別是對(duì)照組的110.52％，105

5、.88％,116.03％,108.59％和99.87％。
　　4.攜帶線粒體tRNATrp5512A＞G突變的永生化淋巴細(xì)胞系線粒體編碼蛋白質(zhì)ND5、CYTB、CO1、CO2、CO3和A6平均表達(dá)水平與正常對(duì)照無(wú)顯著差異。
　　5.氧脅迫下攜帶線粒體tRNATrp5512A＞G突變的永生化淋巴細(xì)胞系的ROS增長(zhǎng)相對(duì)值是正常對(duì)照的121％-155％，平均值為144％(P=0.000)。
　　6.在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中

6、，攜帶線粒體tRNATrp5512A＞G突變的永生化淋巴細(xì)胞系整體ATP產(chǎn)量與正常對(duì)照無(wú)顯著差異(P=0.946)，在以2-脫氧-D-葡萄糖和丙酮酸為碳源的培養(yǎng)基中，細(xì)胞只能通過(guò)線粒體產(chǎn)生ATP，突變型細(xì)胞株的線粒體產(chǎn)能是正常對(duì)照的46.1％-95.7％，平均值為68.4％(P=0.0000)。
　　結(jié)論：
　　1.與正常對(duì)照相比，攜帶線粒體tRNATrp5512A＞G突變的永生化淋巴細(xì)胞系中線粒體tRNATrp的穩(wěn)態(tài)水平顯